复合酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽的工艺研究

蔡金秀 马佳雯 何璐瑶 曹少谦，* 戚向阳，*

（1浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315100；
2上海海洋大学食品学院，上海 201306）

抗冻肽是生物体为适应极端寒冷环境而产生的一类特异性多肽或糖肽。它能够以非依数的方式降低冰晶生长点，而不影响其熔点来抑制冰晶生长和重结晶［1］。1969年，Devries 等［1］在南极鱼的血液中首次发现了抗冻肽（anti-freeze peptide，AFP），之后相继在其他物种中发现了AFP。目前，已在植物［2］、细菌［3］、陆生动物［4］及鱼类［5］等生物体中发现了AFP。

胶原蛋白具有独特的三螺旋结构。胶原蛋白多肽链由Gly-X-Y 氨基酸序列重复而成，X、Y 代表除甘氨酸（Gly）之外的其他氨基酸残基，通常为脯氨酸（Pro）和羟脯氨酸（Hyp）［6］。这一重复单元与Graham 等［7］从雪蚤中提取的2 种AFP 的重复序列-Gly-X-X-非常相似。胶原三肽重复序列中的亲、疏水氨基酸可通过羟基或疏水相互作用与冰晶棱面相结合，抑制冰晶的生长；
同时，胶原多肽中存在的螺旋结构可能在冰晶表面形成独特的平面堆积，从而影响冰晶的生长［8-9］。已有大量研究证明胶原蛋白含有具抗冻活性的多肽片段，并从诸多来源胶原蛋白水解物中分离获得了抗冻肽［10-12］。

本研究以鱿鱼皮胶原蛋白为原料，从酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶中筛选最佳水解用酶，优化鱿鱼皮胶原蛋白的酶解工艺，并对水解产物进行分离纯化与鉴定，旨在获得具有较高抗冻活性的肽段，为抗冻肽的开发与利用及鱿鱼皮的高值化利用提供一定的理论依据。

1.1 材料与试剂

鱿鱼皮收集于宁波路林市场，剥除吸盘，清洗。大肠杆菌一级菌液，生物工程（上海）股份有限公司；
酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶，北京索莱宝科技有限公司；
过氧化氢酶、乙腈、三氟乙酸、细胞色素C（MW12400）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189），美国Sigma 公司；
甲酸，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DK-8D 数显控温水浴锅，上海维城仪器有限公司；
1900PC 紫外-可见分光光度计，上海析谱仪器有限公司；
5804R 台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；
L8900 全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；
ALPHA2-4 真空冷冻干燥仪，德国CHRIST 公司；
超高效液相色谱-质谱联用（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS）仪，上海沃特世科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 鱿鱼皮胶原蛋白的制备 前处理：参考夏珊珊等［13］的方法。称取1 kg 鱿鱼皮粉末，按照料液比1∶10 （w/v）加入0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液浸泡6 h，纱布过滤后蒸馏水洗至中性，按照料液比1∶15（w/v）加入10%异丙醇溶液浸泡20 h。以上操作均在4 ℃下完成。

胶原蛋白的提取：参考Zarai等［14］的方法并稍作修改。取经过前处理的鱿鱼皮，按照料液比1∶100（w/v）加入pH 值4的柠檬酸缓冲溶液，于60 ℃水浴下提取8 h，真空抽滤取上清，盐析、透析后冷冻干燥。

1.3.2 水解度（hydrolysis degree，DH）的测定 氨基态氮的测定：参照《GB 5009.235-2016 食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》［15］第二法。

标准曲线的制作：取0.472 0 g 干燥硫酸铵溶液溶于蒸馏水后定容至1 000 mL 配置成0.1 mg·mL-1的氨氮标准液，再依次移取标准液稀释成0、2、4、6、8、10 μg·mL-1的溶液用于标准曲线的制作。各取1 mL 稀释液于具塞比色管中，依次加入2 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH 值4.8）及2 mL 显色剂（15 mL 37%甲醛与7.8 mL 乙酰丙酮混合，加蒸馏水定容至100 mL），振荡混匀。置于沸水浴中水浴15 min，取出冷却至室温，于400 nm 波长处测定吸光度值。以吸光度为纵坐标，氨氮稀释液浓度为横坐标绘制标准曲线。

样品的测定：取蛋白水解液1 mL定容至50 mL，取1 mL 稀释液于具塞试管中，加入2 mL 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及2 mL 显色剂振荡混匀，沸水浴15 min，冷却至室温，于400 nm 波长处测定吸光度值，同时以蒸馏水为对照做空白试验。氨基态氮计算公式如下：

式中，X为水解液中氨基酸态氮的含量，g·100 mL-1；
m为试样测定液中氨基态氮的质量，μg；
V为测定用试样溶液体积，mL。

水解度（DH）的计算如下：

1.3.3 抗冻肽对过氧化氢酶活的低温保护活性的测定 参照洪燕婷等［16］的方法并稍作修改。称取一定量过氧化氢酶溶于0.05 mol·L-1KH2PO4-NaOH缓冲液（pH 值7.0）中，使最终浓度为0.5 mg·mL-1。将过氧化氢酶液和2 mg·mL-1鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽溶液等体积混合，测定初始酶活力。剩余混合液于-33 ℃冰箱冷冻24 h，取出后在25 ℃下解冻，再放入-33 ℃冰箱冷冻6 h，反复冻融4 次，测定冻融后酶活力。采用冻融后酶活力和初始酶活力比值（过氧化氢酶残余活力）来表示抗冻活力，酶残余活力越大，表明待测样品的抗冻活性越大。

过氧化氢酶活力的测定：在石英比色皿中加入1.9 mL 蒸馏水、0.1 mL 过氧化氢酶与鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽混合液和1 mL 0.1 mol·mL-1过氧化氢溶液，立即摇匀，放入分光光度计样品池中，于240 nm 波长下记录初始吸光值（ΔA240），每隔1 min 记录一次吸光值，共计时5 min。以1 min 内吸光度值减少0.1 酶量为1 个酶活力单位（U）。过氧化氢酶活力和过氧化氢酶残余活力计算公式如下：

1.3.4 鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽制备工艺优化

1.3.4.1 蛋白酶的筛选 在各酶最适温度和pH 值下，用木瓜蛋白酶（55 ℃，pH 值7.0）、碱性蛋白酶（40 ℃，pH 值10.0）、中性蛋白酶（40 ℃，pH 值7.0）、酸性蛋白酶（50 ℃，pH 值2.2）、复合蛋白酶（45 ℃，pH 值7.0），在底物浓度为1%、加酶量为4 000 U·g-1条件下酶解2 h，以过氧化氢酶低温保护活性为主要指标、DH为参考筛选出酶解最佳用酶。

1.3.4.2 单因素试验 用筛选出的最佳酶进行酶解，考察在加酶量为4 000 U·g-1、底物浓度为1%条件下，酶解时间分别为0.5、1、2、3、4、5 h；
底物浓度为1%、酶解时间为3 h 条件下，加酶量分别为2 000、4 000、6 000、8 000 U·g-1；
加酶量为4 000 U·g-1、酶解时间为3 h 条件下，底物浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%时所得鱿鱼皮胶原蛋白酶解产物对过氧化氢酶低温保护活性及水解度的影响。

1.3.4.3 复合酶解 根据单因素结果选取最佳条件进行组合酶解试验，酶解条件如表1所示。

表1 复合酶酶解条件Table 1 Conditions of composite enzyme hydrolysis

1.3.5 相对分子质量分布分析 标样配制：称取细胞色素C（MW12400）、杆菌酶（MW1450）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189）标准品，用流动相溶解配制成0.2 mg·mL-1的标准分子量溶液。

样品制备：称取样品100 mg，溶于流动相定容至10 mL，用0.45 μm微孔过滤膜过滤后进样。

色谱条件［17］：色谱柱：TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm；
流动相：乙腈/水/三氟乙酸=45/55/0.1（v/v）；
检测波长：UV220 nm；
流速：0.5 mL·min-1；
柱温：30 ℃。

1.3.6 氨基酸组成分析 参照Su等［18］的方法。称取20 mg 样品于水解管中，加入5 mL 6 mol·L-1盐酸，真空密封，110 ℃水解24 h。用2 mol·L-1NaOH 溶液将水解液pH 值调至2.2，离心取上清液，用0.02 mol·mL-1HCl定容至50 mL，取1 mL定容液于试管中，氮气吹干后加入2 mL 0.02 mol·mL-1HCl，过0.22 μm 滤膜后用全自动氨基酸分析仪测定样品氨基酸含量。

1.3.7 凝胶柱层析分离 利用Sephadex G-25（1 cm×100 cm I.D.）凝胶柱对在最优水解条件下水解所得鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽进行分离。以蒸馏水为洗脱液，流速0.5 mL·min-1，平衡柱子后上样1 mL，上样浓度100 mg·mL-1，在220 nm 波长处检测，收集各分离峰组分，测定各组分的热滞活性、对过氧化氢酶低温保护活性和对大肠杆菌低温保护活性。

1.3.8 UPLC-MS 分析 色谱条件：色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18 colum（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）。洗脱条件：流动相A 为去离子水（含0.1%甲酸），流动相B 为乙腈。洗脱程序：40 min 内B 由0 变为40%，40～42 min B 由40%变回到0。流速：0.3 mL·min-1。上样量：5 μL。

质谱条件：电喷雾电离源，正离子模式，扫描分子量范围：100～2 000 Da。

质谱参数：毛细管电压：3 000 V，锥孔电压：40 V，喷雾35 psi，脱气温度：350 ℃，离子源温度：120 ℃，N2流速：900 L·h-1。

1.4 数据处理

采用GraphPad Prism 软件绘图，SPSS 软件进行Duncan（D）方差分析，显著性水平为P＜0.05，数据以平均值±标准偏差（mean±SD）表示。

2.1 蛋白酶的筛选

由图1 可知，鱿鱼皮胶原蛋白经酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解所得产物的过氧化氢酶残余活力较强，但碱性蛋白酶酶解产物的水解度显著高于酸性蛋白酶酶解产物。综合考虑，本研究选择碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行复合酶解试验，旨在得到抗冻活性较高的肽段。

图1 不同酶对水解度和过氧化氢酶残余活力的影响Fig.1 Effect of different enzyme hydrolysis on hydrolysis degree and residual activity of catalase

2.2 酶解工艺优化

2.2.1 木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮胶原蛋白单因素试验由图2 可知，木瓜蛋白酶酶解鱿鱼皮胶原蛋白所得产物的水解度随温度的升高先上升后下降，在40 ℃时最高；
随底物浓度的增加而降低；
随加酶量的增加和酶解时间的延长而显著升高。酶解产物的过氧化氢酶残余活力受温度的影响不明显，在45 ℃时有最大值；
在底物浓度为4%时最高；
随加酶量的增大先升高后下降，在加酶量为4 000 U·g-1时最高；
随酶解时间延长先降低后上升，但在酶解3 h后无显著性变化。综合考虑酶解产物的水解度及对过氧化氢酶残余活力，认为在底物浓度4%、加酶量4 000 U·g-1条件下，于45 ℃酶解3 h可获得分子量较小且抗冻活性较高的酶解产物。

图2 温度（A）、底物浓度（B）、加酶量（C）和酶解时间（D）对木瓜蛋白酶酶解的影响Fig.2 Effect of temperature（A），substrate concentration（B），amount of enzyme（C） and enzymelysis time（D） on Papain enzymatic hydrolysis

2.2.2 碱性蛋白酶酶解鱿鱼皮胶原蛋白单因素试验 由图3 可知，碱性蛋白酶酶解鱿鱼皮所得产物水解度随温度和底物浓度的升高呈先上升后下降的趋势，在40～50 ℃时无显著性差异，在底物浓度为3%时最高；
随加酶量增大以及酶解时间的延长而升高。酶解产物的过氧化氢酶残余活力在温度为50 ℃、底物浓度为4%时分别有最大值；
随着加酶量的增加先升高后下降，在酶添加量为4 000 U·g-1时最大；
随酶解时间的延长先升高后下降，在酶解2 h 后显著降低。综上，碱性蛋白酶酶解鱿鱼皮胶原蛋白的最佳条件为：在底物浓度4%、加酶量4 000 U·g-1条件下，于50 ℃酶解2 h。

图3 温度（a）、底物浓度（b）、加酶量（c）和酶解时间（d）对碱性蛋白酶酶解的影响Fig.3 Effect of temperature（a），substrate concentration（b），amount of enzyme（c） and enzymelysis time（d） on alkaline protease enzymatic hydrolysis

2.2.3 复合酶解试验 根据上述单因素试验结果，在木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的最佳条件下进行复合酶解试验，对比了双酶分步酶解及双酶复合酶解与单酶酶解所得产物的水解度和过氧化氢酶残余活力。由图4可知，组合4所得产物的过氧化氢酶残余活力最高，即底物浓度为4%，先由碱性蛋白酶在加酶量4 000 U·g-1、pH值8、50 ℃条件下，酶解2 h；
灭酶后由木瓜蛋白酶在加酶量为4 000 U·g-1，pH值6，45 ℃条件下酶解3 h。此条件下所得酶解产物与过氧化氢酶混合，冻融后过氧化氢酶残余活力可达90.23%，得率为88.36%±0.41%，纯度为94.90%±0.85%。

图4 复合酶酶解对水解度和过氧化氢酶残余活力的影响Fig.4 Effect of using mixed enzymes hydrolysis on degree of hydrolysis and residual activity of catalase

2.3 氨基酸分析

鱿鱼皮胶原蛋白酶解产物的氨基酸组成含量如表2所示，其中与多肽抗冻活性密切相关的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸含量丰富，分别占17.11%、8.15%、6.29%；
其次谷氨酸含量较高（12.99%），谷氨酸含有强极性羟基，这与酶解产物的冰亲和力有关，可增强多肽吸附冰晶表面作用力［19］。同时，酶解产物中天冬氨酸（9.29%）、丙氨酸（6.27%）、精氨酸（8.11%）等脂肪族氨基酸含量也较丰富，脂肪族氨基酸的存在可增强抗冻活性［20］。

表2 鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽的氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of collagen antifreeze peptide from the squid skin

2.4 相对分子质量分布分析

对最佳酶解条件下制备的酶解产物进行相对分子质量分析，结果如图5、表3 所示。鱿鱼皮胶原蛋白酶解产物的总重均分子量为5 310 Da，主要分布于1 000～5 000 Da 之间，占总重的45.58%，其中3 000～5 000 Da 占总重的21.24%。关于高活性的胶原蛋白抗冻肽分子量大小，各研究结论不一。据报道，明胶水解物中分离出的较高抗冻活性组分，分子量分布分别为700～1 400、2 000～5 000 Da［3，21］。本研究鱿鱼皮胶原蛋白酶解产物中高抗冻活性组分分子量分布需通过分离纯化及鉴定进一步分析。

表3 鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽分子量分布Table 3 The molecular distribution of collagen antifreeze peptide from the squid skin

图5 鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽相对分子质量分布图Fig.5 Molecular mass distribution of collagen antifreeze peptide from the squid skin

2.5 凝胶柱层析分离

根据相对分子质量分析选用SephadexG-25 凝胶柱对鱿鱼皮胶原蛋白酶解产物进行分离纯化，其在Sephadex G-25 凝胶柱上的洗脱曲线如图6 所示。经凝胶过滤分离后，分成F1、F2和F33 个组分。由图7 可知，经Sephadex G-25 凝胶柱分离得到的3 个组分中，F2的过氧化氢酶残余活力显著高于分离前酶解产物及F1和F3组分，将F2组分与过氧化氢酶混合，冻融后过氧化氢酶残余活力为95.75%。

图6 凝胶过滤色谱图Fig.6 Chromatogram of gel filtration column

图7 各级分抗冻活性Fig.7 Antifreeze activity of different fractions

2.6 质谱分析

对具有较高活性的F2进行UPLC-MS分析发现，其中主要含有一种抗冻肽（图8），分子离子峰为［M］+1 021 m/z，8个碎片离子峰分别为963 m/z（［M-57］+）、866 m/z（［M-57-97］+）、703 m/z（［M-57-97-163］+）、606 m/z（［M-57-97-163-97］+）、535 m/z（［M-57-97-163-97-71］+）、464 m/z（［M-57-97-163-97-71-71］+）、331 m/z（［M-57-97-163-97-71-71-114-18］+）、226 m/z（［M-57-97-163-97-71-71-114-18-87-18］+），推测这些碎片离子峰分别为失去1 个Gly、Pro、Try、Pro、Ala、Ala、Asn、Ser、Pro 基团形成的，碎片离子峰129 m/z可能为Glu。由此推测此物质可能为10 肽，其氨基酸序列可能为Gly-Pro-Try-Pro-Ala-Ala-Asn-Ser-Pro-Glu或Glu-Pro-Ser-Asn-Ala-Ala-Pro-Try-Pro-Gly。

图8 鱿鱼皮胶原蛋白抗冻肽主成分质谱图Fig.8 MS spectra of major ingredient of collagen antifreeze peptide from squid skin

低温贮藏技术是长期保存食物常用的手段，在低温环境中，冰晶的生长和重结晶作用是损坏食品品质的最主要因素，添加抗冻剂是缓解食品在低温贮藏过程中品质劣变的有效方法之一。目前，商业上使用的抗冻剂多为糖醇类和多聚磷酸盐类，但因其具有一定副作用而在使用中受限。已有研究表明，抗冻肽能有效减少冻藏过程中由冰晶对组织造成的机械损伤并抑制蛋白变性，具有高活性的抗冻肽成为近年来的研究热点［8］。已有大量研究证明胶原蛋白含有具抗冻活性的多肽，鱿鱼皮富含胶原蛋白，本研究以鱿鱼皮胶原蛋白为原料，采用可控酶解技术制备了胶原蛋白抗冻肽，并对其进行分离纯化与鉴定。蛋白酶酶切位点的差异性导致产物氨基酸组成结构的差异，肽的抗冻机制主要包括吸附冰晶表面抑制冰晶生长及改变冰晶形态，这与肽段中的亲水基团和疏水基团密切相关［22-24］。为了得到较高活性的抗冻肽，本研究采用复合酶解法从酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶中筛选出碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶，结果表明，先碱性蛋白酶后木瓜蛋白酶分步酶解所得产物的过氧化氢酶残余活力显著高于双酶混合酶解及先木瓜蛋白酶酶解；
且酶解产物的过氧化氢酶残余活力与其水解度随酶解时间的变化趋势不一致，说明抗冻肽的活性可能与其分子量大小不相关，但孙丽洁等［25］认为分子量较小的肽段抗冻活性较高，对于抗冻活性与肽段分子量大小的相关性有待进一步验证。酶解所得抗冻多肽富含甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸，经分离纯化后3 个组分均具有较高的过氧化氢酶残余活力，其中F2组分高于分离前多肽及F1和F3，将过氧化氢酶与F2组分混合，冻融后过氧化氢酶残余活力可达95.75%。李晓坤［26］研究发现，从猪皮明胶中制备抗冻肽可使过氧化氢酶保留88.2%的活力，而洪燕婷等［16］研究发现，从食源鱼皮明胶中制备抗冻肽可使其保留91.8%活力，抗冻活性均低于本试验所制备抗冻肽。F2组分中主要肽段氨基酸序列可能是Gly-Pro-Try-Pro-Ala-Ala-Asn-Ser-Pro-Glu 或 Glu-Pro-Ser-Asn-Ala-Ala-Pro-Try-Pro-Gly。该肽段中含有胶原蛋白典型重复序列-Gly-X-Y，其中X、Y分别为脯氨酸和酪氨酸，脯氨酸含量丰富。前人研究发现脯氨酸的烷基侧链能够提供非极性环境，稳定氢键，增强多肽与冰晶的结合［27-28］。本研究所得肽段中含有3 个脯氨酸残基，这可能是此肽段对过氧化氢酶低温保护活性强于李晓坤［26］和洪燕婷［16］所得肽段的原因。

本研究表明，鱿鱼皮胶原蛋白酶解的最佳条件为：当底物浓度为4%、加酶量为4 000 U·g-1时，先由碱性蛋白酶于pH 值8、50 ℃条件下酶解2 h；
灭酶后由木瓜蛋白酶于pH 值6、45 ℃条件下酶解3 h，该条件下所得酶解产物与过氧化氢酶混合，冻融后过氧化氢酶残余活力可达90.23%。经分离纯化及质谱鉴定，推测鱿鱼皮胶原蛋白抗冻多肽中具有较高抗冻活性肽段的氨基酸序列是Gly-Pro-Try-Pro-Ala-Ala-Asn-Ser-Pro-Glu 或Glu-Pro-Ser-Asn-Ala-Ala-Pro-Try-Pro-Gly。综上，鱿鱼皮胶原蛋白抗冻多肽有较高抗冻活性，具备作为新型抗冻剂的潜力。

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