二仙汤通过AMPK/mTOR通路保护早发性卵巢功能不全小鼠免受氧化应激及凋亡影响＊

周绵莉，喻小兰，施后渊，刘 娅，王 莉

（西南医科大学附属中医医院 泸州 646000）

早发性卵巢功能不全（Primary ovarian insufficiency，POI）是一种与不规则排卵到过早绝经相关的疾病，表现为闭经或少经并伴有促性腺激素升高和雌二醇（E2）水平下降[1]。POI可导致不孕，并与绝经后骨质疏松症、心血管病、甚至多种恶性肿瘤有关，严重影响女性的生活质量[2]。目前，通常建议患有POI的女性接受长期的激素替代疗法（Hormone replacement therapy，HRT），该疗法可补偿雌激素缺乏并有助于缓解更年期相关症状[3]。然而，HRT引起的规律月经不能满足患者最迫切的需求，即恢复卵巢功能自主排卵[4]。事实上，一半以上POI患者在确诊时，卵巢中还残留着原始卵泡，这些卵泡可以间歇性地发挥作用，但对于POI患者目前还没有经过验证的治疗方法可以恢复卵巢功能[5]。

POI属于中医学“月经后期”、“闭经”、“不孕”等范畴，目前尚不能被完全根治。研究显示，中医药辨证治疗能有效消除临床症状，改善卵巢储备功能，正成为POI极具潜力的治疗方案，传统的汤药、现代的中成药，治疗POI均有明确的效果[6]。二仙汤是20世纪50年代由张伯纳教授经过反复筛选验证而研制出的中药名方，由仙茅、仙灵脾、当归、巴戟天、知母、黄柏、地骨皮及女贞子组成[7]。研究表明，二仙汤可能通过Rab-3、Rab-14等靶点改善卵巢大鼠的认知功能[8]。冒湘琳等[9]报道了二仙汤可改善卵巢储备功能，促进卵泡正常募集和成熟。由于中药成分的复杂性和作用多靶点性，关于二仙汤治疗POI的机制研究还很缺乏，尤其关于其对POI卵巢功能改善作用的研究更少。

5’-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（Adenosine 5’-phosphate-activated protein kinase，AMPK）是哺乳动物细胞中的一种营养和能量感受器，调节糖脂代谢。正常生理条件下AMPK通过维持腺苷核苷酸[腺苷5’-三磷酸（ATP）、腺苷5’-二磷酸（ADP）和AMP]的动态来保护细胞免受各种代谢应激的伤害[10]。研究表明，AMPK与包括乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和胰腺癌在内的多种疾病相关[11-12]。然而，AMPK信号在二仙汤治疗POI的作用尚未完全阐明。

因此，本研究拟探讨二仙汤治疗POI的有效性及对AMPK/mTOR信号通路的影响，以期为二仙汤的应用治疗POI提供理论依据。

1.1 实验动物

BABL/c雌性（SPF级）小鼠48只，7-8周龄，体质量18-22 g，购自成都达硕生物科技有限公司提供，生产许可证号：SCXK（川）2020-030，使用许可证号：SYXK（川）2019-189，自由摄食饮水，饲养于恒温（22-25）℃，相对湿度60%±10%条件下。研究方案经西南医科大学实验动物伦理委员会批准（20220217-012），并按照实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.2 主要试剂及仪器

4-乙烯基环己烯双环氧化物（VCD，货号：94956）购自Sigma；
二仙汤（组方为仙茅、仙灵脾、当归、巴戟天、知母、黄柏、地骨皮、女贞子）购自北京同仁堂科技股份有限公司；
戊酸雌二醇片（批号：219A2）购自德国拜耳药业；
血清促卵泡生成素（FSH，货号：ZC-38059）、雌二醇（E2，货号：ZC-38046）、促黄体生成素（LH，货号：ZC-38253）、活性氧（ROS，货号：ZC-53543）、丙二醛（MDA，货号：ZC-S0343）、超氧化物歧化酶（SOD，货号：ZC-S0350）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px，货号：ZC-38196）试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司；
相关一抗Caspase-3（货号：ab32150）、bax（货号：ab81083）、bcl-2（货号：ab32124）、AMPKα（货号：ab32047）、p-AMPKα（货号：ab133448）、mTOR（货号：ab134903）、p-mTOR（货号：ab109268）购自英国Abcam；
Thermo酶标仪（MK3）上海赛默生物科技发展有限公司；
TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（货号：RR820A）购自北京宝日医生物；
Western细胞裂解液（货号：P0013）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：P0009）购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.3 早发性卵巢功能不全小鼠模型构建及分组

适应性饲养小鼠1周后，均经阴道脱落细胞涂片筛查，性周期正常。随机挑选8只作为空白组，其余40只诱导早发性卵巢功能不全模型。造模步骤参考Hoyer等[13]的方法：造模小鼠每日腹腔注射VCD溶液5 mL·kg-1，空白组小鼠每日注射5 mL·kg-1生理盐水，连续15天。从注射第1天起，每天早上行经阴道脱落细胞涂片检查，根据造模小鼠动情周期紊乱或延长，判断造模成功。

1.4 给药方法

将造模成功后的小鼠随机分为模型组、阳性药物组（戊酸雌二醇片）、二仙汤低剂量组、二仙汤中剂量组、二仙汤高剂量组，每组8只。后开始灌胃给药，阳性药物组按每次0.3 mL给予戊酸雌二醇片水溶液，二仙汤高、中、低剂量组分别按 12 g·kg-1、8 g·kg-1、4 g·kg-1灌胃，空白组和模型组给予生理盐水每次0.3 mL，连续6周。其中，二仙汤的制备：按10 g仙茅、10 g仙灵脾、10 g当归、15 g巴戟天、10 g知母、10 g黄柏、15 g地骨皮、12 g女贞子分别取药材，加入双蒸水浸泡30 min，后煎煮、过滤、浓缩至生药量为1.2 g·mL-1。按“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”配制低、中和高剂量药液。戊酸雌二醇片用三蒸水溶解制成溶液，每毫升溶液含戊酸雌二醇0.009 mg。

1.5 观察指标

1.5.1 卵巢组织病理学观察及卵泡计数

取小鼠卵巢组织，经4%中性多聚甲醛固定24 h后，石蜡包埋切片，厚3-5 μm，HE染色，光镜下进行形态学分析和卵泡计数，根据已发表的描述和定义卵泡被检测并分类为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和闭锁卵泡[14]。

1.5.2 血清激素及卵巢组织氧化应激指标测定

通过腹主动脉采集各组小鼠血液样品，3500 r·min-1离心15 min，收集上清液，采用试剂盒检测小鼠的血清激素水平：E2、LH、FSH水平。取小鼠卵巢组织，将卵巢组织在冰PBS中冲洗，滤纸吸干后，剪成小块，加入5 mL PBS在冰上用玻璃匀浆器匀浆，再进行2次反复冻融，进一步破碎细胞膜，匀浆物以5000 r·min-1离心20 min，取上清液，按试剂盒测定卵巢组织中ROS、MDA、SOD和GSH-Px的含量。

1.5.3 免疫组织化学法检测Caspase-3、bax、bcl-2表达

固定的卵巢组织经冠状面切成5 μm厚的连续切片，切片用含3% H2O2的过氧化物酶阻断剂孵育30 min，以阻断内源性过氧化物酶活性和非特异性抗原。洗涤后用正常山羊血清封闭切片15 min。随后，用Caspase-3（1∶100）、bcl-2（1∶100）、bax（1∶100）特异性一抗孵育切片过夜。洗涤后与生物素标记的二抗在37℃孵育2 h，DAB显色，苏木精反染，脱水、透明，阳性细胞染成棕色，在放大倍数（40×）下每张切片计数5个视野，确定Caspase-3、bax以及bcl-2阳性染色的强度。

1.5.4 TUNEL染色检测卵巢组织细胞凋亡

取卵巢组织，用4%多聚甲醛固定24 h后，包埋，连续切片，厚度5 μm，TUNEL染色观察卵巢组织细胞凋亡情况。

1.5.5 qRT-PCR检测AMPKα、mTOR mRNA表达

应用TRIzol试剂卵巢组织中提取RNA，将mRNA反转录为cDNA。使用TB Green PreMix ex Taq II试剂盒进行实时PCR。以β-actin为内参。引物序列：AMPKα：上游引物5’-CAGTGATGAGGTGGTGGAGCA GAGGT-3’，下游引物5’-GTGAATGGTTCTCGGCTGT GCTGGAA-3’；
mTOR：上游引物5’-AGAGGACCAGC AGCACAAGCAGGA-3’，下游引物5’-TGGTGCAGTGG TGGTGGCATT-3’；
β-actin：上游引物5’-AGCGGGAA ATCGTGCGTGAC-3’，下游引物5’-ACTCCTGCTTGCT GATCCACATC-3’。以95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10 s条件进行PCR反应，45个循环，记录CT值，2-ΔΔCT分析相对表达水平。

1.5.6 Western blot检测AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR蛋白表达

将卵巢组织匀浆于放射免疫沉淀分析缓冲液（RIPA）中，在4℃下5000 r·min-1离心后，收集上清液，用BCA试剂盒检测蛋白质浓度，然后在95℃变性5 min。将等量的蛋白质负载到8%的SDS-PAGE凝胶上，通过电泳分离并转移到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶室温孵育1 h后，分别与抗AMPKα、p-AMPKα、mTOR、p-mTOR（均1：500）或β-actin（1∶1000）在4℃孵育过夜，再与辣根过氧化物酶偶联二抗在室温下孵育2 h，ECL检测免疫反应条带，化学发光成像系统采集图像，Image J软件分析光密度，以β-actin为内参，对照组目标蛋白质相对含量为1，计算各组蛋白质的相对表达量。

1.6 统计学分析

使用SPSS 22.0进行数据统计分析，数据表示为平均值±标准差（），两组间均数比较采用LSD-t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2.1 二仙汤对早发性卵巢功能不全小鼠卵巢组织病理学、卵泡计数的影响

空白组卵泡的颗粒细胞层排列规则，无明显变化；
模型组卵泡的颗粒细胞层排列紊乱，各级生长卵泡数量减少、闭锁卵泡数量增多。与模型组比较，4个治疗组的卵泡颗粒细胞排列较为规则，大多卵泡结构较为完整，治疗后各级生长卵泡数量增多、闭锁卵泡数量减少，其中二仙汤高剂量组对卵巢形态及卵泡数显示出更明显的改善作用。如图1。

2.2 二仙汤对早发性卵巢功能不全小鼠血液激素水平的影响

与空白组比较，模型组E2含量明显降低，LH、FSH含量明显增加（P＜0.01）；
与模型组比较，仅二仙汤高剂量组均明显升高E2含量，明显降低LH、FSH含量（P＜0.05）。见表1。

2.3 二仙汤对早发性卵巢功能不全小鼠氧化应激的影响

与空白组比较，模型组ROS、MDA含量明显升高，SOD、GSH-Px活性明显降低（P＜0.05）；
与模型组比较，戊酸雌二醇组、二仙汤高剂量组ROS含量明显降低，GSH-Px活性明显升高（P＜0.05）；
二仙汤高剂量组ROS、MDA含量明显降低，SOD、GSH-Px活性明显升高（P＜0.05）。见表2。

图1 各组小鼠组织病理变化及卵泡计数（HE染色）

表1 各组小鼠血清E2、LH、FSH、AMH含量变化

2.4 二仙汤对早发性卵巢功能不全小鼠组织细胞凋亡的影响

免疫组化结果显示，与空白组比较，模型组Caspase-3、bax表达明显增加，bcl-2表达明显降低（P＜0.01）；
与模型组比较，戊酸雌二醇组、二仙汤低、中、高剂量组Caspase-3表达明显降低，bcl-2表达明显升高（P＜0.05），二仙汤高剂量组 bax表达明显降低（P＜0.05）；
与戊酸雌二醇组比较，二仙汤高剂量组bax表达明显降低（P＜0.05）。（图2A，2C）。TUNEL荧光染色结果显示，与空白组比较，模型组细胞凋亡明显增加（P＜0.05）；
与模型组比较，戊酸雌二醇组、二仙汤低、中和高剂量组细胞凋亡被明显抑制（P＜0.05）。（图2B，2C）。

2.5 二仙汤对早发性卵巢功能不全小鼠AMPK/mTOR信号通路的影响

qRT-PCR检测结果显示，与空白组比较，模型组AMPKα、mTOR mRNA表达明显降低（P＜0.05）；
与模型组比较，二仙汤高剂量组AMPKα、mTOR mRNA表达明显升高（P＜0.05）。Western blot检测结果显示，与空白组比较，模型组AMPKα、mTOR蛋白表达无明显差异统计学意义（P＞0.05），p-AMPKα、p-mTOR蛋白表达明显降低（P＜0.05）；
与模型组比较，治疗组AMPKα、mTOR蛋白表达无明显差异统计学意义（P＞0.05），二仙汤中、高剂量组p-AMPKα和p-mTOR蛋白表达明显升高（P＜0.05）。见图3。

表2 各组小鼠卵巢组织ROS、MDA、SOD、GSH-Px含量

图2 各组小鼠细胞凋亡比较

图3 各组小鼠卵巢组织AMPK/mTOR通路相关因子变化

3.1 二仙汤治疗改善POI卵巢功能及氧化应激

卵泡计数是卵巢功能的重要指标，研究显示，卵泡衰竭是由宫内期原始卵泡池形成不足、卵泡消耗增加、自身免疫性或中毒性卵泡降解引起的，且当卵巢卵泡的正常功能被病理过程阻断时将会发生卵泡功能障碍[15]。本研究结果显示，POI小鼠卵巢内卵泡的颗粒细胞层排列紊乱，原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡较空白组减少，而闭锁卵泡数量呈现增加，二仙汤可改善此现象。此外，卵巢功能还主要体现在内分泌和生殖功能上，抗苗勒氏管激素可抑制颗粒细胞对FSH的敏感性，从而在优势卵泡选择中发挥作用[16]。此外，氧化应激与女性和男性的逆行生殖病例的病因有关[17]，ROS水平较高的卵巢功能早衰患者中服用辅酶Q可以改善胚胎质量[18]，提出氧化应激的增加与卵巢功能早衰相关的卵巢炎有关[19]，且高ROS水平导致线粒体异常，可能会导致因氧化磷酸化和卵子生成紊乱而产生低的三磷酸腺苷、卵细胞数量减少以及卵巢功能早衰[20]。在本研究中，POI小鼠LH、FSH、ROS、MDA 含量明显升高、E2含量及SOD、GSH-Px活性明显降低；
二仙汤高剂量可逆转上述因子水平。与Ağaçayak等[21]的研究报道一致，证明POI小鼠出现动情周期紊乱，卵巢功能损害，氧化应激指数升高，二仙汤可改善POI小鼠的卵巢功能及氧化应激水平。

3.2 二仙汤治疗可抑制POI细胞凋亡及激活AMPK/mTOR信号通路

细胞凋亡在女性生殖系统的生长和发育中起重要作用，不同的应激刺激可导致细胞凋亡，证据表明，ROS的产生可诱导细胞凋亡[22]。然而，目前为止还没有研究探讨二仙汤对POI诱导的细胞凋亡的抑制作用。虽然细胞凋亡的作用和机制仍然存在许多问题，但证据证实，细胞凋亡与mTOR信号通路调节密切相关。此外，AMPK介导的mTOR激活抑制了卵泡闭锁期间卵巢颗粒细胞的凋亡[23]。AMPK/mTOR信号通路参与凋亡、自噬和细胞存活，AMPK的激活可以抑制mTOR的磷酸化，而mTOR可以通过调节下游信号分子来阻断细胞凋亡，如抑制Caspase-9的激活，以及灭活bcl-2家族成员[24]。Liu等[25]研究发现AMPK/mTOR信号通路可能激活了壬基酚诱导的大鼠卵巢颗粒细胞凋亡和自噬。且证据表明，AMPK信号通路可被氧化应激激活[25]。另外，mTOR激活mTORC1并增加下游基因Rheb、S6k1、4E-BP1的表达来增强卵母细胞内的蛋白转录进而促进卵泡的发育[26]。雌激素能够激活AMPK，导致E2和LH水平变化，进一步反馈性调节FSH、LH分泌[27]。本研究结果显示，POI小鼠卵巢中Caspase-3、bax表达及细胞凋亡明显升高，bcl-2表达、AMPKα、mTOR mRNA及p-AMPKα、p-mTOR蛋白表达明显降低；
二仙汤高剂量组Caspase-3、bax表达及细胞凋亡明显降低，bcl-2表达、AMPKα、mTOR mRNA 及 p-AMPKα、pmTOR蛋白表达明显升高。提示二仙汤能够抑制POI卵巢组织细胞凋亡及刺激AMPK/mTOR通路显著激活。

综上所述，二仙汤可改善早发性卵巢功能不全小鼠的卵巢功能及氧化应激，其保护作用可能是由AMPK/mTOR信号通路介导的，然而，尚需要更多的研究来确定二仙汤对POI的改善作用，特别是二仙汤的多靶点作用，可能为未来POI治疗的潜在方向，也为今后基于网络药理学分析，系统综合地观察二仙汤对POI的干预与影响奠定基础。

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