PP2A抑制剂LB-100通过促进TNF-α和IL-6产生治疗白念珠菌感染

郭 文， 王中伟， 吴梦雪， 贾鑫明

(同济大学医学院，上海 200092)

白念珠菌(CandidaAlbicans)是一种常见的机会致病真菌，是引起侵袭性念珠菌病的最主要因素[1-2]。在一些免疫力低下的个体(如艾滋病患者、器官移植患者和癌症患者)中，能够通过血液传播到机体其他脏器从而发展成危及生命的全身感染，导致严重的致死率[2-3]。目前临床上主要是棘白菌素类和唑类药物用于治疗念珠菌病，但抗生素的滥用会导致耐药菌株的出现甚至引起严重的念珠菌血症[4]，因此，减少抗生素的使用，迫切需要开发一种新的抗白念珠菌感染的药物。

蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A, PP2A)是哺乳动物中常见的一种高度保守的丝/苏氨酸磷酸酶，通过其去磷酸化活性参与调节各种细胞功能，包括细胞信号转导、细胞周期和细胞凋亡[5-7]。已有研究证明，PP2A是人类恶性肿瘤中良好的治疗靶点，其变构灭活可抑制肿瘤的发生发展[8-9]。此外，PP2A的活性也会影响糖尿病和阿尔兹海默病的发生[10-11]，但其在真菌感染中的作用目前尚不清楚。LB-100是一种特异性的PP2A抑制剂，是斑蝥素的小分子衍生物，由于其毒性较低，目前已进行临床 Ⅱ 期研究用于治疗实体瘤[12-13]。

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族参与体内多种重要信号通路，其中p38-MAPK信号通路参与调节细胞功能，如细胞凋亡、分裂、侵袭和炎症反应[14]。当受到应激刺激后，p38-MAPK磷酸化并激活下游底物丝裂原活化蛋白激酶2(MAPK-activated protein kinase 2, MK2)，磷酸化的MK2可以激活多种底物，如热休克蛋白27(heat shock protein 27, Hsp27)、cAMP效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)和三四脯氨酸(tristetraprolin，TTP)。TTP是一种RNA结合蛋白，通过结合转录本3′非翻译区(3′-untranslated region, 3′UTR)中的富含腺嘌呤/尿苷的元件(adenosine and euridine rich elements, AREs)调节多种基因的转录稳定性，如TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ等，在维持基因组稳定性方面起着重要作用[15]。已有研究表明，PP2A通过TTP的去磷酸化使其失活从而调控炎症的发生发展[16-17]。

本研究探讨LB-100在体内和体外白念珠菌感染模型中的作用及机制，为念珠菌病的治疗提供新的思路。

1.1 实验动物及试剂

DMEM基础培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；
TRIzol购自美国Invitrogen公司、PrimerScript RT Master Mix反转录试剂盒、SYBR PCR Master Mix试剂盒购自日本TaKaRa公司；
10%SDS-PAGE预混制胶缓冲液和转膜液购自美国Bio-Rad公司；
Lipofeca-mineTM2000购自美国Thermofisher公司;TNF-α和IL-6 ELISA试剂盒购自美国eBioscience公司；
放线菌素D(actinomycin D, ActD)购自美国MCE公司；
p-p65、p-p38、TTP和GAPDH抗体购自上海艾比玛特生物医药有限公司；
ECL发光液购自上海默克生命科学有限公司；
C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克公司。

1.2 白念珠菌的培养

从白念珠菌标准菌株SC5314中挑选单个菌落，置于YPD培养基中30 ℃培养过夜,随后洗涤计数酵母细胞，重悬于RPMI 1640培养基中，37 ℃培养3 h诱导成菌丝态。

1.3 Western印迹法检测

1.4 骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow derived macrophages, BMDMs)的制备

1.5 RNA的提取和qPCR

使用TRIzol试剂分离细胞总RNA,并使用NanoDrop测定RNA浓度；
反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA模板；
使用Power SYBR Green PCR预混液进行cDNA扩增，GAPDH作为内参来测定相关基因的表使用达。使用Primer 5.0设计引物，见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.6 细胞因子引物由检测

分别用白念珠菌酵母态或菌丝态，α-mannan或β-glucan刺激BMDMs 24 h,同时加入不同浓度(1、5、10 μmol/L)的LB-100处理；
然后收集上清液，通过ELISA试剂盒测定TNF-α和IL-6的蛋白水平。

1.7 小鼠系统性念珠菌病模型

白念珠菌感染通过向小鼠尾静脉注射200 μL含有3×105个SC5314的PBS悬浮液，PP2A抑制剂LB-100通过腹腔注射给药，在感染后监测并记录小鼠存活率；
感染48 h后收集各组小鼠的肾脏和肝脏，用PBS稀释匀浆后的器官并接种在SDA板上，30 ℃培养48 h后计数菌落形成单元(colony forming units, CFU)。

1.8 统计学处理

所有统计分析均由GraphPad Prism软件进行，两组均数间比较使用t检验分析，多组间比较使用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 LB-100治疗增强小鼠抗白念珠菌感染的能力

为了确定LB-100在小鼠抗白念珠菌感染中的作用，本研究使用LB-100或PBS预处理C57小鼠，然后静脉注射SC5314(3×105/只)感染小鼠。Kaplan-Meier分析显示，LB-100治疗组显著提高了小鼠的生存率，见图1A。为了评估小鼠各脏器的荷菌量情况，感染48 h后处死小鼠，收集小鼠的肾脏和肝脏，计数菌落形成单元(CFU)，结果显示，LB-100治疗组小鼠的脏器荷菌量显著低于对照组，见图1B，表明LB-100治疗可增强小鼠抗白念珠菌感染的能力。

图1 LB-100治疗增强小鼠抗白念感染的能力Fig.1 LB-100 treatment enhances the ability of mice to resist C.albicans infectionA：
C.albicans(3×105)感染后C57小鼠生存率；
B：
感染后48 h肾脏、肝脏荷菌量分析；
*P<0.05;**P<0.01

2.2 LB-100促进BMDMs细胞因子的分泌

为了探究LB-100在白念珠菌感染诱导的细胞因子产生中的功能，本研究分别使用SC5314酵母态和菌丝态刺激BMDMs。与对照组相比，LB-100处理组显著增加了促炎因子TNF-α和IL-6的表达，见图2A、2B。使用SC5314来源的α-mannan和β-glucan刺激BMDMs，同时加入不同剂量的LB-100，LPS作为阳性对照。结果发现LB-100也能够显著增强BMDMs细胞因子的分泌，并且该趋势是呈剂量依赖性的，见图2C、2D，说明LB-100处理主要是提高BMDMs应答真菌表面PAMP的能力进而增加巨噬细胞在白念珠菌刺激下细胞因子的产生。因此本研究将探究LB-100增强BMDMs对真菌表面多糖β-glucan应答能力的机制。这些结果也表明LB-100通过抑制PP2A促进促炎因子TNF-α和IL-6的产生增强机体抗白念感染免疫。

图2 LB-100处理促进BMDMs细胞因子的分泌Fig.2 LB-100 treatment promotes cytokine secretion in BMDMsA、B：
热灭活的白念珠菌酵母态和菌丝态刺激BMDMs 24 h，同时加入LB-100处理(5 μmol/L)，MOI=5，ELISA检测上清液中TNF-α和IL-6的水平;C、D：
白念珠菌来源的β-glucan(50 μg/mL)和α-mannan(50 μg/mL)刺激BMDMs 24 h，LPS(100 ng/mL)作为阳性对照,同时加入不同剂量的LB-100处理，ELISA检测上清液中TNF-α和IL-6的水平；
*P<0.05;**P<0.01;***P≤0.001

2.3 LB-100抑制PP2A活性增强BMDMs细胞因子mRNA的表达和稳定性

本研究使用β-glucan刺激小鼠BMDMs，同时加入不同浓度的LB-100共孵育，第0、1、4、6 h收集细胞总RNA，qPCR检测各组TNF-α和IL-6 mRNA的表达水平。结果显示，LB-100处理组TNF-α和IL-6 mRNA水平显著高于未处理组，并且随着LB-100剂量的提高，其mRNA的表达水平也显著增强，见图3A、3B。放线菌素D(ActD)是一种mRNA合成的抑制剂，将BMDMs进行β-glucan和LB-100预处理后，加入ActD刺激，LB-100处理组TNF-α和IL-6 mRNA的半衰期显著提高，见图3C、3D，说明mRNA稳定性增加是LB-100处理导致TNF-α和IL-6表达上调的主要原因。

图3 LB-100处理促进BMDMs细胞因子mRNA的表达及稳定性Fig.3 LB-100 treatment promotes the expression and stability of cytokine mRNA in BMDMsA、B：
白念珠菌来源的β-glucan刺激BMDMs，同时加入LB-100处理，qPCR检测细胞中TNF-α和IL-6 mRNA的水平;C、D：
β-glucan(50 μg/mL)和LB-100(5 μmol/L)预处理BMDMs 4 h，加入ActD刺激,qPCR检测细胞中TNF-α和IL-6 mRNA的水平，绘制半衰期曲线；
*P<0.05;**P<0.01;***P≤0.001

2.4 LB-100处理增强TTP的表达并增强IL-6 mRNA的稳定性

为了明确LB-100治疗对于信号通路的影响，本研究使用β-glucan刺激小鼠BMDMs并加入LB-100共孵育。与对照组相比，LB-100处理组p38与p65的磷酸化显著增强，但奇怪的是TTP的表达也显著增加，见图4A、4B。使用RNA干扰技术对TTP进行敲低后发现，当TTP的表达被抑制，TNF-α的表达显著升高，但IL-6的表达却略有下降，见图4C、4D。说明上调TTP的表达能够提高IL-6 mRNA的水平。为明确LB-100对IL-6 mRNA稳定性的调控依赖于mRNA的3′UTR区域，本研究将报告基因GFP连接IL-6 mRNA的3′UTR导入BMDMs中，发现LB-100处理显著抑制GFP的降解过程。以上结果表明，LB-100通过上调TTP的表达进而增强IL-6的表达，且此过程依赖于IL-6 mRNA的3′UTR区域，见图4E。

图4 LB-100对p38MAPK-TTP信号通路的影响Fig.4 The effect of LB-100 on p38MAPK-TTP signaling pathwayA：
β-glucan(50 μg/mL)刺激BMDMs,同时加入LB-100(5 μmol/L)处理，Western印迹法检测各蛋白磷酸化水平；
B：
定量分析；
C、D：
RNA干扰技术敲低BMDMs中TTP的表达，β-glucan刺激4 h，qPCR检测细胞中TNF-α和IL-6 mRNA的水平；
E：
瞬时转染技术将GFP插入小鼠BMDMs IL-6的3′UTR区域，Western印迹法检测GFP的表达；
*P<0.05;**P<0.01;***P≤0.001

本研究证明了PP2A抑制剂LB-100能够增强小鼠抗白念珠菌感染的能力。LB-100治疗显著增加了白念珠菌感染小鼠的存活时间并降低了脏器荷菌量，LB-100治疗能够增强相关促炎因子的表达并延长其mRNA的半衰期，并且LB-100正调IL-6 mRNA的稳定性依赖于TTP。因此，通过LB-100增强TNF-α和IL-6 mRNA表达从而促进机体抗白念珠菌感染可能是一种新的治疗策略。

TTP是一种富含脯氨酸的锌指蛋白，其能够与mRNA的3′UTR区域结合从而诱导mRNA的降解[18-19]。已有研究证明，p38能够通过磷酸化TTP促进mRNA的稳定性，而PP2A能够使TTP去磷酸化加速mRNA的降解[16]。TTP已被证明是一种抑炎和抗癌蛋白，通常通过mRNA的转录后调控发挥效应[20-21]。TTP是许多慢性炎症疾病的重要治疗靶标，如类风湿性关节炎，慢性阻塞性肺病和炎症性肠病等[22-24]。此外，TTP还可作为临床上癌症诊断的生物标志物，上调TTP的表达有助于不同癌症的诊断和治疗，改善患者的预后[25-27]。甚至TTP活性的抑制还可增强中性粒细胞对细菌的识别和清除[28]。已报道PP2A通过去磷酸化TTP抑制其与mRNA的结合能力,但是其在真菌感染中的作用还未见报道。

本研究证明LB-100处理显著提高了BMDMs中TNF-α和IL-6 mRNA的表达。同时，LB-100处理提高了BMDMs中p38和p65的磷酸化，其中p38的磷酸化水平显著性提高。NF-κB家族转录因子和p38激酶在细胞因子mRNA转录起始过程中发挥重要作用，本研究表明TNF-α和IL-6 mRNA含量的增加主要由于其mRNA的稳定性增强导致，所以认为LB-100通过增强p38的磷酸化从而激活mRNA转录起始的功能为发挥主要作用。

研究表明，TTP能够结合TNF-α mRNA的3′UTR 进而促进mRNA的降解。本研究使用siRNA抑制TTP的表达后，显著提高了TNF-α mRNA的含量。尽管LB-100处理后TTP表达显著增加，但LB-100处理能够抑制PP2A的活性，增强TTP的磷酸化进而促进TTP与TNF-α mRNA的解离，显著提高TNF-α mRNA的稳定性。与此同时，本研究首次发现，TTP在调控IL-6 mRNA表达的过程中发挥维持mRNA稳定性的作用，并且该过程也依赖于IL-6 mRNA的3′UTR，但TTP增强mRNA稳定性的机制仍需进一步研究。

LB-100是天然产物斑蝥素的衍生物，无明显毒性，能特异性抑制PP2A的活性，目前处于临床Ⅱ期阶段用于治疗二级、三级和四级星形细胞瘤及巨细胞型胶质母细胞瘤。本研究通过对白念珠菌感染的小鼠进行不同剂量的LB-100治疗，数据表明LB-100治疗后小鼠的生存时间明显延长，肾脏和肝脏的荷菌量也显著下降。LB-100可通过抑制PP2A调控TTP的表达从而提高小鼠抗白念珠菌感染的能力，为临床抗白念珠菌治疗提供新的靶点。

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