翘嘴鳜早期基因c-fos的分子特征与表达

张丽欣，梁旭方，武佳琪

（华中农业大学水产学院/鳜鱼研究中心，湖北 武汉 430070）

Fos基因家族由c-fos、fosb、fosl1、fosl2等4 个成员组成。早期基因c-fos被第二信使诱导激活，作为第三信使接收信号，参与氧化应激诱导的衰老、衰老相关分泌表型（SASP）、FCERI 介导的MAPK 激活、AP-1 转录因子家族的激活[1]和白细胞介素-4 和白细胞介素-13 信号传导等信号通路，属于原癌基因家族中的一员，在细胞生长、分化和信息传导中有重要作用[2]，在学习记忆[3-4]、牙齿和骨骼异常[5]、免疫[6]等方面发挥重要功能。大鼠（Rattus norνegic）水迷宫空间训练研究发现，在大脑区域c-fos免疫反应神经元核数量的增加与空间训练有关[7]。大鼠莫里斯迷宫位置导航和空间探测试验发现，经过8 周游泳训练，大鼠空间学习记忆能力显著提高，c-fosmRNA 表达上调17%[8]。果蝇（Drosophila melanogaster）通过反复同时暴露于气味和电击来形成厌恶嗅觉关联，发现果蝇中的长期记忆印迹细胞是通过细胞自主ERK 依赖性c-fos/CREB 循环建立的[9]。

目前，在鱼类中只在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）脑中鉴定c-fos相关基因并对该基因进行神经激活诱导，从虹鳟大脑中分离出两个部分cDNA克隆（RT-fos1和RT-fos2），它们编码与高等脊椎动物的C-FOS 蛋白同源的蛋白质[10]。另外，c-fos基因序列已在其他五种鱼类基因组中鉴定出两个同源序列fosaa与fosab。

翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）为中国一类重要的经济淡水鱼。底栖生长的翘嘴鳜仅摄食活饵料鱼，拒绝摄食人工饲料与死饵[11-12]，在人工养殖过程中，驯化[13]变得尤为重要。鉴于c-fos在学习记忆方面的重要作用，研究早期基因c-fos在翘嘴鳜中的学习记忆功能有助于攻克这一难题。梁慧等[14]克隆了翘嘴鳜fosaa，发现翘嘴鳜基因fosaa的表达影响了食欲相关基因pomc和npy的表达，可能参与了其摄食调控[14]。翘嘴鳜在死饵料鱼驯食实验（学习组）中，与活饵料鱼组相比，fosabmRNA 表达量显著上升[15]。本研究克隆翘嘴鳜fosab基因亚型的编码区，分析fosaa、fosab的分子特征，以及两个亚型在不同组织及投喂饲料不同时期脑中mRNA 表达量，为c-fos学习记忆功能研究提供支撑。

1.1 材料

实验用健康翘嘴鳜成鱼（180 g ± 10 g）及幼鱼（20～30 g）取自华中农业大学鳜鱼研究中心，取成鱼脑、眼、鳃、肝、胃、肠、脾、肾、心、鳔、精巢、肠系膜脂肪、肌肉和皮肤14 个组织；
幼鱼经过驯化[13]成功摄食饲料，驯化流程如表1 所示，每天9:00、17:30 饱食投喂饲料，选取饲料驯食7 d（短期组）和56 d（长期组）的翘嘴鳜（每组6 尾鱼），取其脑于液氮暂存，保存在-80 ℃下备用。使用Trizol（TaKaRa,Tokyo,Japan）法提取各组织总RNA。用诺唯赞反转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行cDNA合成，保存在-20 ℃待用。

表1 驯食人工饲料技术流程Table 1 Domestication process of artificial feeding

1.2 翘嘴鳜fosaa、fosab基因序列分析

从NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、翘嘴鳜全基因组数据库（http://genomes.igb-berlin.de/）中获取翘嘴鳜fosaa与fosab全基因组和氨基酸序列。利用Gene Structure Display Server 2.0 在线工具绘制蛋白结构示意图。使用在线网站NPSA-PRABI（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）和SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/），输入翘嘴鳜fosaa和fosab基因的fasta 格式氨基酸序列，预测翘嘴鳜FOSAA和FOSAB蛋白二级、三级结构。

1.3 翘嘴鳜fosab基因克隆及系统进化分析

用Primer Premier 6.0 软件根据fosab编码区设计引物（表2），PCR 扩增翘嘴鳜fosab基因的开放阅读框（ORF）区，将片段大小正确的PCR 产物送到擎科公司（北京擎科生物科技有限公司）测序验证。利用MEGA 5.0 软件对鱼类和高等脊椎动物中fosaa、fosab亚基进行多重比对，构建fosaa、fosab的系统进化树，利用NJ 分析法得到类似的树形拓扑结构，节点值表示从1 000 次复制中获得可信度百分比。利用Megaline 软件进行蛋白序列比对，对fosaa、fosab同线性分析。

表2 所用PCR引物Table 2 PCR primers information

1.4 实时荧光定量PCR及数据分析

利用Primer Premier 6.0 软件设计翘嘴鳜fosaa、fosab基因特异性引物（表2），以rpl13a为内参基因，采用实时荧光定量PCR 检测fosaa、fosab基因在健康成鱼各组织以及驯化后幼鱼脑中的表达，每组样品重复3 次。扩增反应程序为95 °C 3 min；
95 °C 30 s，退火30 s，退火温度见表1，共39个循环。采用单因素方差分析实时荧光定量结果。

用SPSS Statistics 24.0 软件对fosaa、fosab基因的相对表达量进行独立样本t检验，数值均采用平均值±标准误表示，当P＜0.05时，差异显著；
当P＜0.01时，差异极显著。

2.1 翘嘴鳜fosaa和fosab序列分析

经克隆并测序验证获得fosab的基因编码区序列，通过数据库基因组序列得到fosab基因全长2 498 bp，ORF 区的长度1 152 bp；
根据翘嘴鳜全基因组数据库，fosaa基因全长2 871 bp，ORF 区的长度1 143 bp；
fosaa、fosab均有四段外显子（图1），DNA 序列相似性40.4%。基因fosaa和fosab均定位于翘嘴鳜第16号染色体上，翘嘴鳜FOSAA蛋白含α螺旋34.83%，β 折叠0.79%，无规则卷曲55.15%，FOSAB 蛋白含α 螺旋24.80%，β 折叠0.52%，无规则卷曲63.71%。翘嘴鳜FOSAA 和FOSAB 蛋白bZIP结构域分别位于126～191 bp 和127～192 bp。翘嘴鳜FOSAA 和FOSAB 蛋白二级结构和三级结构见图2、3。

图1 翘嘴鳜fosaa和fosab基因结构Fig.1 Structures of gene fosaa and fosab in Siniperca chuatsi

图2 翘嘴鳜FOSAA、FOSAB蛋白二级结构Fig.2 Secondary structure of protein FOSAA and FOSAB in Siniperca chuatsi

图3 翘嘴鳜FOSAA、FOSAB蛋白三级结构Fig.3 Tertiary structure of protein FOSAA and FOSAB in Siniperca chuatsi

2.2 翘嘴鳜FOSAA和FOSAB进化分析

图4 可见，翘嘴鳜fosaa和fosab基因与大黄鱼（Larimichthys crocea）聚在一起，再与底鳉（Fundulus heteroclitu）、青鳉（Oryzias latipes）聚为一支，最后与其他鱼类汇聚，这与脊椎动物分类地位一致。翘嘴鳜FOSAB与哺乳动物C-FOS亲缘关系比与FOSAA关系更近，鱼类的FOSAA 单独聚为一支。c-fos基因在亲缘关系排序中，哺乳动物与鸟类、两栖类、鱼类的亲缘关系越来越远，可用于物种进化辨别基因。c-fos基因在智人、鼠、黑猩猩（Pan troglodytes）、牛（Bos taurus）、绵羊（Oνis aries）、原鸡（Gallus gallus）和热带爪蟾（Xenopus tropicalis）中相对保守。序列相似性分析（表3）表明，翘嘴鳜FOSAB 与鱼类以外其他物种C-FOS 序列相似性在60%左右，而FOSAA 基因与鱼类以外其他物种C-FOS 序列相似性在45%左右。翘嘴鳜FOSAB 进化比FOSAA 更保守，其FOSAA 与FOSAB 蛋白序列相似性为46.0%（表3），与图4 结果一致。同线性分析（图5）表明，翘嘴鳜C-FOS处于tmed10和jdp基因之间，与其他鱼类相似。所选三种鱼类中fosab基因与智人等动物的c-fos在FOS 左侧均有tmed10，而三种鱼类中fosaa基因与人等动物的c-fos基因在FOS 右侧均有jdp，在鱼类中c-fos进化相对保守。

图4 翘嘴鳜与其他鱼类、哺乳动物、鸟类、两栖动物C-FOS系统发育进化树Fig.4 Phylogenetic tree of C-FOS in Siniperca chuatsi and other fishes,mammals,birds and amphibians

图5 翘嘴鳜与其他鱼类、哺乳动物、鸟类、两栖动物c-fos同线性Fig.5 Gene c-fos of Siniperca chuatsi is linear with that of other fishes,mammals,birds,and amphibians

表3 翘嘴鳜C-FOS 氨基酸序列与其他鱼类、哺乳动物、鸟类、两栖动物的相似性Table 3 Amino acid sequence similarity of C-FOS between Siniperca chuatsi and other fishes,mammals,birds,amphibians

2.3 翘嘴鳜fosaa与fosab健康组织表达

图6 表明，fosaa和fosab基因在健康翘嘴鳜不同组织中的表达模式不同，fosaa和fosab基因在脑和皮肤中均有较高的表达量，其中fosaa在脑中表达量最高，fosab在皮肤中相对表达量最高。翘嘴鳜fosaa基因在鳔、鳃、肝、肌肉和脂肪中表达量极低或者不表达，fosab基因在鳔、心和脂肪中相对表达量极低或无。

图6 翘嘴鳜fosaa和fosab基因的组织表达Fig.6 Tissue expression of fosaa and fosab genes in Siniperca chuatsi

2.4 翘嘴鳜投喂饲料后fosaa 和fosab mRNA 表达水平

图7 显示，翘嘴鳜投喂饲料56 d 时，fosaa基因表达量比7 d时显著升高（P ＜0.05），而fosab基因相对表达量在饲料投喂7、56 d 时无显著差异（P＞0.05）。

图7 翘嘴鳜投喂饲料后fosaa和fosab基因相对表达量Fig.7 Relative expression of fosaa and fosab genes in Siniperca chuatsi after feed domestication

3.1 翘嘴鳜fosaa和fosab基因生物信息学分析

本研究表明，翘嘴鳜fosaa与fosab基因序列差异较大，fosaaDNA 序列及氨基酸序列与fosab的相似性均低于50%。翘嘴鳜FOSAB 与鱼类以外其他物种C-FOS 序列相似性在60%左右，而其FOSAA与鱼类以外其他物种C-FOS 序列相似性在45%左右，其FOSAB 进化比FOSAA 更保守。斑马鱼（Danio rerio）C-FOS同源物中保护率最高的区域是bZIP 结构域，而FOSAB 的C-DEST 区域比FOSAA更保守[15]，与本研究结果一致。进化分析表明，翘嘴鳜fosaa和fosab基因与其他鱼类汇聚为一分支，这与其他脊椎动物分类地位一致。翘嘴鳜FOSAB 蛋白与哺乳动物、鸟类和两栖类中C-FOS 亲缘关系比与FOSAA关系更近，其fosab基因可能与哺乳动物、鸟类和两栖类的功能更为相似。在斑马鱼FOS 分支中，c-FOS、FOSB 和FOSL2 蛋白有一个明显的亚分支，c-FOS 旁系fosaa与fosab相比差异甚大[16]。相同基因的不同亚型可能发挥着不同的功能，翘嘴鳜fosaa基因和fosab基因可能发挥不同功能。

3.2 翘嘴鳜fosaa和fosab基因健康组织表达

基因在不同组织中的表达模式是探究基因功能的基本手段之一[17]。本研究表明，翘嘴鳜fosaa和fosab基因在脑和皮肤中表达量均较高，斑马鱼中有相同结果[16]，翘嘴鳜fosaa与fosab在眼、肾、脾、胃、肠均有中等表达水平，在鳔和脂肪中表达量均较低，与斑马鱼fosaa和fosab基因在肾、眼有中等表达量的结果一致[16]，其中fosaa在脑中表达含量最高，fosab在皮肤中相对表达量最高。这可能与c-fos调节多种不同类型细胞对刺激的反应，并参与细胞对表皮生长因子及神经生长因子的反应[18-19]有关。fosaa和fosab在翘嘴鳜眼中均有表达，可能与视网膜等组织功能相关，c-fos+/+和c-fos-/-小鼠的视网膜在强光照射（15 000 lx,2 h）长达10 d 后，在c-fos-/-小鼠中，视杆不受影响，仅在c-fos+/+小鼠中观察到杆中的线粒体损伤，c-fos控制光诱导视网膜光感受器凋亡[20-21]。另外，翘嘴鳜c-fos基因在心和肾组织中的中等表达水平可能与心脏[22]和肾脏[23]等疾病有关。

3.3 翘嘴鳜投喂饲料驯化后fosaa 和fosab mRNA脑中表达水平

本研究表明，fosaa基因在短期（7 d）、长期（56 d）投喂饲料的翘嘴鳜脑中表达量有差异，在长期投喂组显著升高，是短期组的1.6 倍，而短期、长期饲料投喂组间fosab表达量均无显著差异。雏鸡在记忆检索训练结束后1和24 h触发了大脑中c-fos大量表达[24]，大鼠在学习社会传播食物偏好（STFP）实验中，短期记忆测试均表现出对实验所选食物的显著偏好；
在长期记忆测试中，注入c-fos反义寡脱氧核苷酸的大鼠对实验所选食物没有偏好，而注入c-fos寡脱氧核苷酸或盐水的大鼠则保持偏好，表明c-fos寡脱氧核苷酸对于巩固非空间海马依赖性记忆是必要的[25]。通过社会学习，翘嘴鳜c-fos、mch基因表达量升高，pomc基因表达量降低，CaMKII-c-fospomc可促进鳜食性从摄食活鱼转变为摄食死鱼，进而获得新的进食习惯，并大大提高食物摄入比率[15,26]。综上可见，翘嘴鳜fosaa与fosab基因在学习记忆中可能发挥不同功能，学习记忆相关基因fosaa可能在驯食中发挥着更重要作用。

1）本研究克隆翘嘴鳜fosab基因，通过进化树分析和蛋白同源性比对发现，翘嘴鳜fosaa和fosab基因分属进化树不同枝，差异较大，相同基因不同亚型的功能不尽相同。

2）翘嘴鳜fosaa和fosab基因在不同组织中表达不同，两者在脑和皮肤中表达量均较高，在鳔和脂肪中表达量均很弱，在眼、肾、脾、胃、肠均有中等表达水平。

3）对翘嘴鳜投喂饲料驯化后，二基因在短期、长期驯化组脑中fosaa和fosabmRNA 表达水平不同，fosaa基因在长期组表达量显著升高（P＜0.05），翘嘴鳜学习记忆相关基因fosaa在驯食中发挥着更重要作用。

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