CHO,细胞多基因工程改造策略的建立及应用

程静雯 曹磊 张艳敏 叶倩 陈敏 谭文松 赵亮，

（1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237；
2.上海倍谙基生物科技有限公司，上海 201203）

CHO 细胞作为目前生物制药工业领域生产重组蛋白的“主力军”，拥有诸多优势，如生长快速、易于适应无血清悬浮培养、易于放大、生产工艺成熟、易转染以及安全性高等［1-3］。尽管CHO 细胞获得了广泛的应用，但其存在代谢效率低、代谢行为难以调控、产品质量控制困难、细胞株遗传不稳定等诸多特点［4-8］，在某种程度上限制了治疗性重组蛋白工业化生产效率的进一步提升。长期以来，建立适合工业应用的高效表达重组蛋白的CHO 工程细胞株面临着重大挑战。近来，人们经常在基因组上引入有利于细胞生长维持或目标蛋白表达的基因来提高CHO 细胞的性能［9］。但传统随机整合的方法存在许多根本性问题，如整合位点不可控而带来的不确定性。通过定点整合（site-specific integration, SSI）将目的基因（gene of interest, GOI）整合在基因组特异性位点处，能够有效避免随机整合带来的不稳定性。随着基因编辑工具的高速发展，CRISPR/Cas9技术凭借成本效益高、易于使用、设计简单等优点，获得了广泛的应用，其中以基因敲入和基因敲除最为常见［10］。由于CHO 细胞生物信息学数据的不断完善，基因组定点编辑在CHO 细胞中已有成功的尝试［11-13］。

近年来，通过单次基因过表达或破坏基因表达来改变CHO 细胞某个单一功能的工程改造方法日趋成熟。如在提高细胞抗凋亡水平方面，Safari 等［14］在基因组Caspase7位点敲入EGFP基因以破坏Caspase7 蛋白的表达，Tan 等［15］过表达HSP27 蛋白，这两种方式均获得了具备抗凋亡能力的细胞株。然而，往往单个基因的改造只能改变单一表型甚至无法改变表型。因此，多基因同步改造成为具有卓越性能的下一代工程细胞株构建的必经之路。在一项对CHO 细胞悬浮适应的研究中，Lee 等［16］利用CRISPR/Cas9 技术同步敲除5 个基因，结果表明Igfbp4基因和AqpI基因的功能缺失加速了CHO-K1细胞的悬浮适应。目前，多基因同步改造主要用于多基因敲除或单基因片段删除［17］。然而迄今为止，多基因同步改造仍缺少将破坏基因和过表达基因结合的同步改造方法。目前改造后细胞的特性往往仅源于敲入的基因或敲除的基因，这导致细胞功能单一，并且限制了多基因同步改造的广泛应用。

本研究选取细胞凋亡途径中抗凋亡基因Bcl-2和蛋白岩藻糖基化通路中岩藻糖合成的关键酶基因FUT8作为模型基因，以此建立适合工业应用工程细胞株构建的定点同步敲入敲除基因编辑策略，并验证、评估其应用潜力和可行性。这将促进应用于生物制药工业领域的下一代工程细胞株的产生，既可节省多个重复步骤堆叠的时间，加速工程细胞株改造进程，又能大大提升表型调控的成功率。

1.1 材料

pSpCas9（BB）-2A-Puro（PX459）V2.0 来 源 于Addgene，E.coliDH5α 感受态购自擎科生物科技有限公司，所需引物均由擎科生物科技有限公司合成，CHO-K1 细胞系源自美国ATCC 公司，血液/组织/细胞基因组提取试剂盒、无内毒素质粒小提中量试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司，BbsI-HF、NotI-HF、XmaI-HF、AflII-HF、MfeI-HF、T7EI、T4 连接酶均购自NEB，DMEM 培养基购自上海倍谙基生物科技有限公司，胎牛血清购自上海BIOSUN 公司，胰酶购自美国GIBCO 公司，高保真酶DNA 聚合酶、无缝重组克隆试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡检测试剂盒、cDNA 合成试剂盒、通用型qPCR 预混液、CCK-8 试剂盒均购自翌圣生物科技股份有限公司，LCA Dylight 649 购自美国Vectorlab 公司，重组Anti-Bcl-2 抗体购自Abcam 公司，HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）、嘌呤霉素、上样缓冲液均购自碧云天生物技术有限公司，10% SDS-PAGE、ECL 发光液均购自上海雅酶生物医药科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA/Cas9 表达质粒构建及sgRNA 基因编辑效率检测 由NCBI 网站在线工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找到CHO-K1 细胞基因组FUT8基因序列（Gene ID: 100751648），选择FUT8基因外显子1 和外显子2 作为靶序列。根据网站（http://crispr.mit.edu/）中CRISPOR 系统对sgRNA 有效性与潜在脱靶位点的预测，设计了3 条sgRNA 并合成相应寡核苷酸链，如表1 所示。先将寡核苷酸链退火结合，再用BbsI-HF 酶切PX459 质粒载体，利用T4连接酶将退火产物和酶切载体连接起来，经转化和测序得到阳性单菌落，扩大培养并提取质粒，即得sgRNA/Cas9 表达质粒。将构建好的sgRNA/Cas9 表达载体转染CHO-K1 细胞，获得转染细胞池。提取该细胞池的基因组，以提取到的基因组为模板进行PCR 扩增反应，PCR 所用引物如表2 所示。将PCR产物进行退火反应，在退火产物中加入1 μLT7EI酶，于37℃下反应30 min，反应产物使用琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 sgRNA 寡核苷酸链Table 1 sgRNA oligos

表2 T7E I 酶切实验引物Table 2 PCR primers for T7E I enzymatic digestion assay

1.2.2 供体表达盒的设计与构建 供体表达盒中各元件包括启动子、目的基因、报告基因、连接子、转录终止信号和靶点上下约800 bp 同源序列。人源Bcl-2基因（Gene ID: 596）由基因合成所得，其他各元件片段均采用高保真DNA 聚合酶进行PCR 扩增反应获取，片段与酶切载体之间连接均采用无缝重组克隆试剂盒中重组酶进行，再经转化、测序后提取质粒。同源序列选取sgRNA2 5′-ATAAAACAATAAGGTCCCCC-3′引导Cas9 切割位置的上下游长约800 bp 片段，称之为同源臂（arm）。供体表达盒的结构为5′arm-CMV（E+P）-Bcl2 -T2AEGFP-bGH poly（A）-3′arm，质粒图谱如图1 所示。

图1 供体质粒的图谱Fig. 1 Map of donor plasmid

1.2.3 细胞转染及稳定细胞株构建 将细胞提前以4×105cells/well 接种于六孔板中。待细胞汇合度约80%-90%，将供体表达盒线性化片段和sgRNA/Cas9表达质粒以摩尔比1∶1 共转染CHO-K1 细胞。供体表达盒线性化片段是以Bcl-2 供体质粒为模板进行PCR 扩增反应获得的，经纯化后使用。细胞转染48 h 后传2-3 代，收集细胞，利用流式分选仪将表达增强绿色荧光蛋白的（enhanced green fluorescent protein, EGFP）单克隆细胞分选出来，接种至96 孔板里，每孔含有200 μL 生长培养基。

1.2.4 基因分子水平检测 提取EGFP 阳性单克隆细胞基因组，以提取的基因组为模板，反应条件如下：95℃ 3 min；
35X：95℃ 15 s；
62℃ 15 s；
72℃ 45 s/kb；
72℃ 5 min，进行5′ junction PCR、3′ junction PCR 和out-out PCR 三轮PCR 鉴定，所需引物如表3 所示。5′junction PCR 和3′ junction PCR 是检测基因定点整合情况，out-out PCR 是鉴定单克隆细胞是纯合子还是杂合子。

表3 定点整合验证所需引物Table 3 Primers for site-specific integration

提取目标单克隆细胞的总RNA，并逆转录成cDNA。以GAPDH基因为内参，利用qPCR 检测内源性Bcl-2基因、外源性Bcl-2基因和FUT8基因的mRNA 相对表达量。所需引物如表4 所示，结果使用2-△△CT计算得到mRNA 的相对表达量。

表4 qPCR 引物序列Table 4 Primers for qPCR

1.2.5 目的蛋白表达水平检测 使用流式细胞术分析荧光比例及强度对EGFP 蛋白表达进行检测，均以野生型CHO-K1 细胞为阴性对照。流式细胞术检测前，细胞需用PBS 缓冲溶液洗涤几遍，并用其重悬至密度约为1×106cells/mL。Bcl-2 蛋白检测采用Western blot 方法。取100 μL 裂解液裂解1×106个细胞沉淀，4℃ 12 000 r/min 离心30 min，收上清。样品于95℃沸水煮5 min。将制备好的样品加进10% SDS-PAGE 胶孔里，浓缩胶80 V 跑15 min，分离胶恒压120 V跑75 min。电泳结束后，以恒压120 V，100 min 的条件进行转膜。PVDF 膜于封闭液中室温下缓慢摇晃1 h。之后，一抗孵育2 h，4℃过夜。次日，二抗孵育1 h，最后用多功能凝胶成像分析仪获得图像。

1.2.6 无血清条件培养下细胞活力检测 以每孔8 000 个细胞接种在96 孔板中，每孔100 μL 培养基，以野生型CHO-K1 细胞作为对照组，设置不加细胞的空白组。培养18 h，将培养基更换为无血清培养基，连续培养72 h 和96 h，用CCK-8 试剂检测72 h和96 h 的细胞活率。

1.2.7 细胞FUT8 蛋白酶功能检测 利用小扁豆凝集素（lens culinaris lectin, LCA）与细胞膜N-聚糖上的核心岩藻糖特异性的结合验证FUT8 蛋白酶功能。以每孔4×105个细胞接种于六孔板中培养18-24 h。每孔加入终浓度为20 μg/mL 荧光标记的小扁豆凝集素（Dylight 649-LCA），室温反应45 min。反应结束，使用流式荧光术检测荧光比例。

1.2.8 细胞抗凋亡性能评估 嘌呤霉素可以应用于诱导细胞凋亡。以每孔3×105个细胞接种于六孔板中培养18-24 h，更换培养基为带有终浓度为10 μg/mL 嘌呤霉素的新鲜培养基。24 h 后，消化收集细胞，通过双染法检测细胞凋亡分布的比例。

2.1 sgRNA基因编辑有效性检测

在CHO-K1 细胞基因组FUT8基因外显子1 和外显子2 共设计了3 条sgRNA。通过T7EI 酶切实验检测sgRNA 在CHO-K1 细胞内实际基因编辑效率。若细胞池内发生了基因编辑事件，那么Cas9切割双链DNA 形成了缺口，在缺口处会发生碱基错配，则T7EI 酶能特异性识别并切割错配的双链DNA。T7EI 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2，每个泳道中红色箭头标注的条带即为T7EI 酶切后形成，说明sgRNA 在靶点处能够有效编辑。对图中条带灰度值进行分析，得到sgRNA 的有效编辑效率，分别为9.85%、10.1%和3.02%，因此后续均使用sgRNA2 进行实验。

图2 sgRNA 基因编辑效率检测结果Fig. 2 Results of sgRNA gene editing efficiency

2.2 定点同步敲入敲除基因编辑策略的建立

2.2.1 定点同步双敲细胞株的获得 根据定点同步敲入敲除基因编辑策略原理图（图3），通过该策略成功发生定点整合事件的细胞株能够表达绿色荧光，未发生定点整合事件的细胞株则无法表达绿色荧光。将供体表达盒线性化片段与sgRNA/Cas9 表达载体共转染细胞，收集共转染后的细胞株，利用流式分选仪分选出EGFP 阳性的单克隆细胞，接种于96 孔板中，培养12-14 d。

图3 定点同步敲入敲除基因编辑策略原理图Fig. 3 Schematic diagram of the site-specific synchronous knock-in and knock-out gene editing strategy

在荧光显微镜下标记表达绿色荧光的单克隆细胞并提取其基因组DNA。以提取的基因组为模板，进行5′ junction PCR、3′ junction PCR 和out-out PCR 3 轮PCR 扩增反应。通过3 轮反应，从36 个表达绿色荧光的单克隆细胞中，筛选出3 个在FUT8 靶基因处成功整合供体表达盒片段的单克隆细胞，故成功实现定点整合的占比为8.3%，剩下33 个表达绿色荧光的单克隆细胞为随机整合细胞，占比为91.7%。如图4 所示为其中一株成功实现定点整合的单克隆细胞株的鉴定结果，从图中可知，该单克隆细胞的基因组DNA 经5′ junction PCR 和3′ junction PCR 均扩增出一条明显条带。由测序结果显示5′端同源臂以及CMV（E+P）片段缺失了部分序列，但剩余CMV（E+P）片段仍能作为启动子使用。3′junction PCR 扩增产物的序列基本符合预期设计。由此验证了供体表达盒片段被精确整合到FUT8基因靶点处。Out-out PCR 产物的电泳结果显示，野生型细胞扩增片段大约2 200 bp，成功定点整合的单克隆细胞扩增片段约4 700 bp，符合预期扩增产物的大小且条带单一、明亮，表明该单克隆细胞株为纯合子，即为通过定点同步敲入敲除基因编辑策略构建的工程细胞株，简称为定点同步双敲细胞株。

图4 定点同步双敲细胞分子鉴定结果Fig. 4 Molecular identification results of the site-specific synchronous double-knock cell

2.2.2 定点同步双敲细胞株敲入和敲除基因的表达水平 供体表达盒片段成功整合于CHO-K1 细胞FUT8基因靶点处，可通过qPCR、Western blot 和流式细胞术鉴定表达盒中基因的表达水平。由图5-A-C结果显示（****P<0.000 1，**P<0.01，n=3），当内源性Bcl-2基因mRNA 转录水平几乎无差异时，细胞外源性Bcl-2基因的mRNA 表达量远高于野生型CHO-K1 细胞，说明外源Bcl-2基因在CHO-K1 细胞内成功过表达。由于供体表达盒上存在转录终止信号元件，故FUT8基因靶点后序列没有成功转录。经过Western blot 和流式细胞术检测，如图5-D, E 所示，说明了EGFP 绿色荧光蛋白和Bcl-2 蛋白过表达成功。

当细胞中FUT8 酶的功能丧失后，细胞就不能正常合成含有核心岩藻糖的N-聚糖的膜蛋白，则不能与LCA 结合。如图5-F 所示，与野生型CHO-K1细胞相比，定点同步双敲细胞无法与LCA 相结合，在荧光通道下不显示荧光，FUT8 酶蛋白功能性丧失，FUT8基因敲除成功。

图5 定点同步双敲细胞基因表达水平Fig. 5 Gene expressions of the site-specific synchronous double-knock cell

2.3 定点同步敲入敲除基因编辑策略的可行性评估

2.3.1 定点同步双敲细胞株基因表达稳定性评估 对细胞连续传代培养，利用流式荧光仪对传代40 d 和60 d 的细胞的绿色荧光蛋白表达比例与荧光强度定量分析。如图6 结果所示，定点双敲细胞表达绿色荧光蛋白的比例及荧光强度经传代培养维持稳定，表明通过定点同步敲入敲除基因编辑策略构建的工程细胞株能够至少维持60 d 基因表达稳定。

图6 基因表达稳定性结果Fig. 6 Stability results of gene expression

2.3.2 定点同步双敲细胞株在无血清培养基下的活力 在无血清培养条件下，如图7 所示，定点同步双敲细胞的活细胞比例均比野生型细胞提高了约30%（*P<0.05，n=3）。可见在无血清条件下，定点同步双敲细胞由于Bcl-2 蛋白过表达赋予了细胞在缺少生长因子时的自我保护能力，展现出对血清剥夺的耐受度更强。

图7 无血清条件下细胞活率Fig. 7 Cell viability under serum-free condition

2.3.3 定点同步双敲细胞株抗凋亡性能鉴定 将细胞处于10 μg/mL 嘌呤霉素条件下诱导培养24 h 后，如图8 结果所示（*P<0.05，**P<0.01，n=3），定点同步双敲细胞无论是晚期凋亡还是早期凋亡水平，均低于野生型细胞。在活细胞水平上，定点同步双敲细胞高于野生型细胞约30%。该结果表明，Bcl-2蛋白过表达能够使细胞抵御由凋亡诱导剂引发的细胞凋亡，对于细胞具有一定程度抗凋亡的保护作用。

图8 定点同步双敲细胞抗凋亡性能评估Fig. 8 Evaluation on the anti-apoptotic properties of the site-specific synchronous double-knock cell

近年来，关于如何进一步提升CHO 细胞工业化生产效率的问题，研究员们已经进行了多方面的尝试。其中，通过各类基因工程技术改变宿主细胞特性以获得更强健的工程细胞株的方式，获得了广泛应用。但经基因工程改造后的细胞株仍可能存在各种问题，例如，表型没有明显变化导致无法达到预期效果、稳定性欠佳等，这些问题成为限制其进一步工业化应用的主要障碍。本研究通过合理的设计，建立了可行的适合工业应用工程细胞株构建的定点同步敲入敲除基因编辑策略，该策略中敲入和敲除的基因均能够发挥作用，一次操作赋予细胞多个新的特性。

对于大规模工业化生产治疗性蛋白而言，将CHO 细胞适应于无血清悬浮培养是一个必不可少的环节。本研究构建的定点同步双敲细胞株具备较好的抗凋亡性能，该细胞株对血清剥夺的耐受性更高，有望在细胞悬浮适应中表现出更大的优势，有应用于工业化生产的潜力。FUT8 蛋白是哺乳动物细胞中岩藻糖合成途径的关键酶，破坏FUT8 蛋白表达有利于细胞表达低岩藻糖或无岩藻糖的重组抗体。据报道，岩藻糖的存在会抑制抗体重链 Fc 区与NK细胞膜上FcγRIIIa 受体的结合，可显著影响抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC）的活性［18］，而去除岩藻糖的重组抗体则拥有更高的ADCC 活性。因此，定点同步双敲细胞株可应用于生产低岩藻糖或无岩藻糖的治疗性蛋白，由此也说明定点同步敲入敲除基因编辑策略具有可行性与潜在的应用价值。

本研究结果表明，定点同步双敲细胞株5′端表达盒和同源臂部分的连接属于不完整连接，其丢失了表达盒的部分序列。这种不完整连接可能是由于使用了线性化DNA 片段转染细胞，而在核酸外切酶的作用下以及染色体末端切除，可能会导致在细胞内供体表达盒DNA 片段末端发生降解，因此，基于避免不完整连接发生的基因敲入方式的研究具有重要意义。除了通过同源定向修复（homology-dependent recombination, HDR）介导实现了基因敲入外［19］，Wang 等［20］以非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）介导的方式也能够达到基因敲入的目的，实现多基因整合。与HDR 途径相比，NHEJ 途径可活跃于整个细胞周期内［21］，但应用于基因敲入时可能会存在表达盒插入方向的问题［22］，故用于提高基因敲入效率的基于不同修复途径的供体载体模板的设计仍待进一步优化。除了供体载体的优化能够影响基因整合效率外［23-24］，使用如NHEJ 途径抑制剂等化学处理方式通过影响NHEJ 途径或HDR 途径，从而改善基因敲入水平［25］。但有研究表明，化学处理并没有改善HDR 介导的靶向整合［26］，说明CHO 细胞对这类试剂不敏感，因此对于调节通路的试剂还可以进一步筛选与尝试。

本研究建立了定点同步敲入敲除基因编辑策略，该策略构建的CHO 双功能细胞株，不仅具备较好的抗凋亡性能，且FUT8 蛋白酶功能也遭到破坏。由此表明该策略具备较好的可行性和实际工业应用潜力。

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