赤羽病全球流行动态与防控策略

王世荣,昝晓慧,巩彩风,王 炜*

(1.内蒙古大学 生命科学学院 省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室,内蒙古 呼和浩特 010070;2.内蒙古蒙微生物科技有限公司,内蒙古 呼和浩特 011500)

赤羽病又名阿卡斑病(Akabane disease,AKAD)、先天性关节弯曲-积水性无脑综合征(congenital arthrogryposis-hydranencephaly syndrome,AH),是由阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)引起的牛、羊临床上以流产、早产、先天性关节弯曲和积水性无脑征(arthrogryposis-hydraencephaly,AH综合征)为特征的传染病。该病于1949年在日本群马县赤羽村首次发生,但病原直到1959年从该地采集的金色库蚊(AedesVexans)和三带缘库蚊(CulesTritaeniorhynchis)体内分离到病毒才得以确认,并命名为赤羽病病毒[1],之后澳大利亚、肯尼亚、南非、以色列等国家也相继分离到病毒。AKAD是世界动物卫生组织(OIE)规定的通报性疫病之一,我国将其列为二类进境动物疫病,是国内牛、羊进境时必检的动物疫病之一[2]。

1.1 病原学分类AKAV属于布尼亚病毒目(Bunyavirales)布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)正布尼亚病毒属(Orthobunyavirus)成员,从血清学角度,归为辛布血清群(Simbu serogroup)。AKAV为有囊膜的单股负链分节段RNA病毒,基因组为12 kb,由3个片段构成,分别为L(约6 868 nt),M(约4 309 nt)和S(约858 nt)[3]。L片段编码RNA依赖的RNA聚合酶,其在病毒的转录和复制中起重要作用。M片段编码高甘露糖型GP前体(GPC),该GP前体被宿主细胞蛋白酶切割后产生2种包膜糖蛋白G1、G2和非结构NSm蛋白,包膜糖蛋白分别诱导产生中和抗体、血凝抑制抗体,构成该病毒的纤突;NSm蛋白影响病毒的复制,可能是影响病毒毒力的一个因素[4]。S节段编码病毒的核衣壳蛋白(N蛋白)和1个非结构蛋白(NSs蛋白),两者高度重叠,N蛋白上具有群特异性,抗原保守性高,可诱导机体产生抗体。NSs蛋白存在于受感染细胞的细胞核,通过诱导细胞核的破坏而抑制细胞抗病毒反应或诱导细胞死亡[5]。

由于AKAV基因组是分节段RNA病毒,病毒具有较大的变异性,对临床分离毒株进行分析表明,病毒间具有重组现象。根据病毒的L、M和S不同基因片段,可将AKAV分为不同的基因群。研究表明,病毒的S片段序列相对保守,常常用于病毒的遗传进化分析。目前,基于S、M片段序列,AKAV分离株可分为4个基因群(Ⅰ～Ⅳ),其中基因群Ⅰ又可划分为Ⅰa和Ⅰb[2]。在分子流行病学研究方面基因分群具有重要的意义。

AKAV在50～60℃作用30 min即失去感染性,一般消毒剂如1%漂白粉、2%戊二醛、75%消毒酒精等均可杀灭病毒。

1.2 流行现状自1949年在日本群马县赤羽村首次发生赤羽病以来,该病己广泛流行于除欧洲外的大多数地区,尤其是东南亚、中东、非洲等诸多地区。

1.2.1AKAV在亚洲地区的流行 日本是赤羽病流行的重灾区,1959年,日本首次从蚊子中分离到AKAV JaGAr39株(AB000852),属于基因群Ⅱ[1]。此后历史上发生多次大规模流行。1972-1975年,日本关东地区发生赤羽病,导致超过4万头犊牛发生流产,造成了巨大的经济损失[6]。通过对本次流行毒株的分析,证实引起大流行的毒株属于基因群Ⅱ,其典型代表毒株为OBE-1株(AB000851),是1974年从自然感染的牛胎中分离所得。1989年,日本鹿儿岛县首次报道了10头犊牛发生脑炎,从犊牛的小脑中分离出AKAV,命名为Iriki株(AB289321),属于Ia基因亚群,而且这次疫情中该毒株感染的每头犊牛均出现非化脓性脑炎的组织病理学变化[7],表明Iriki分离株具有嗜神经性、神经毒力,能引起神经功能紊乱。1990年,日本南部分离到FO-90-3株(AB232198),属于Ⅰb基因亚群[8]。1998年,日本大部分地区出现了严重的小牛先天性异常病例的暴发,小公牛表现出呼吸急促、发热、过敏和共济失调,通过病毒抗原检测证明为AKAD[9]。2011年,日本报告了165例因感染AKAV导致的牛脑脊髓炎病例,从受感染动物分离出的病毒与2010年引起韩国大规模暴发的病毒株高度同源,韩国分离毒株与Iriki株具有一定的关系,表明这些毒株可能源于日本病毒株的进化和变异,意味着韩国和日本家畜之间存在某种流行病学联系。截至到目前,日本流行毒株属于基因群Ⅰ(Ⅰa和Ⅰb)和基因群Ⅱ,其中基因群Ⅱ毒株很少引起牛的脑炎症状。对近些年来的病例和毒株基因分析显示,由基因群Ⅰ引起的牛的脑炎症状的病例逐渐增多。此外,2011年和2013年基因群Ⅰ病毒感染猪的报道值得关注。

1978-1980年,韩国京畿道地区多次暴发AKAD,这是韩国最早报道AKAD疫情[10]。1993年,从1头流产奶牛的胎儿基质和1头健康奶牛的血液中分别分离到AKAV 93FMX株(FJ498797)和K-9株(DQ973189),属于基因群Ⅱ[11]。2000年,韩国首次报告成年牛感染AKAV,出现神经系统症状。2005年从牛血中分离到的K0505株(FJ498796)及2006年从流产小牛中分离出来的AK7株(FJ498795)均属于基因群Ⅱ[12]。2010年,由AKAV感染引起4～7月龄牛的脑脊髓炎大规模暴发,感染牛表现为共济失调、震颤和过敏等神经体征。从脑和脊髓标本中分离到15株AKAV毒株的同源性高达99.9%～100%,其典型代表株AKAV-7/SKR/2010(JQ308771)与日本分离毒株Iriki同源性最高,属于Ⅰa基因亚群,这2个毒株都能引起犊牛和成年牛的脑炎症状[13]。到目前为止,韩国从牛血、流产小牛和脑、脊髓等分离到AKAV,毒株属于基因群Ⅰ和基因群Ⅱ。

1996年,中国台湾地区报道了从AKAV感染导致非化脓性脑炎的小牛中分离出多株AKAV,这些分离株与AKAV Iriki株具有相同的抗原性,但与JaGAr39株(AB000852)和OBE-1株(AB000851)的抗原性较远,这是中国台湾地区首次分离到AKAV[14]。1998年,李其平等[15]在上海蚊虫中分离出3株AKAV[15],这是首次在我国大陆地区分离到AKAV。2003年,HUANG等[16]在中国台湾无症状的猪身上分离出1株名为NT-14(AF529883)的AKAV,属于Ⅰa基因亚群。2010年,冯云等[17]在云南的蚊虫中分离出2株AKAV,分别是DHL10M117株和DHL10M110(KP144999)株,通过进化树分析表明DHL10M110株和DHL10M117株与日本、韩国和中国台湾地区的AKAV分离株亲缘关系较近,与肯尼亚和澳大利亚AKAV分离株进化关系较远。2010-2011年,从湖南省致倦库蚊和中华按蚊中分离到6株AKAV[18]。2013-2016年,从广西竹鼠体内分离到5株新的AKAV[19]。2016年从中国广西的1只哨兵羊的血液中分离到1株名为GXDH01(MH174977)的AKAV,属于Ⅰa基因亚群,经序列分析,该病毒可能是OBE-1的重组毒[20]。2016年,我国首次从牛血清中分离到1株AKAV,命名为TJ2016(MT761688),与 JaGAr39和JaLAB39株分离毒株亲缘关系较近,属于AKAV基因群Ⅱ[21]。2017年,从我国云南省西南边界西盟县的牛血样本中分离出1株名为V38/YN/2018的毒株,经分析,该毒株S片段与日本KS-2/Mo/06(AB373232)毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为97.66%,M片段与中国DHL10M110毒株亲缘关系最近,核苷酸同源性为96.56%[22]。截止到目前,我国从蚊子、山羊、竹鼠、牛血清等分离到了AKAV,这些毒株属于Ⅰa基因亚群和基因群Ⅱ,还没有从发病牛分离出AKAV的报道。2021年,我国包括东北地区在内的多个地方发生赤羽病,但目前尚未见病毒基因分型的相关资料。

2005年在越南的三带喙库蚊中分离到4株AKAV[23];2017年,从印度尼西亚的西爪哇地区无症状的牛血浆中分离到1株AKAV,命名为WJ-1SA/P/2014(LC113954),该毒株与2001年和2015年以色列和土耳其的分离株亲缘关系较近,属于Ⅰb基因亚群,这也是印度尼西亚首次分离到AKAV[24];同时在东南亚地区其他国家如马来西亚,菲律宾等也有AKAV的分离报道。经病毒进化树分析发现,流行于东南亚国家的AKAV几乎都为基因群Ⅰ。

1979年,在土耳其患有AH综合征的犊牛中检测到AKAV抗体[25]。1988年,沙特阿拉伯、也门、阿曼等国家检出AKAV血清抗体阳性[26],1991年,从阿曼的淡翅库蠓和山羊中分离到2株AKAV[27]。2001年,以色列从伊米库蚊分离的AKAV毒株名为ISR-01[28],属于Ⅰ群。2002年,以色列出现了首例伴有脑部畸形水肿的“失明新生小牛”综合征病例,经中和试验证实与AKAV感染有关[29]。2015年,土耳其从流产的绵羊胎儿中分离出2株病毒,命名为Aksu-1(KU296969)和Aksu-2(KU296970),经分析属于AKAV Ⅰb基因亚群,这是土耳其关于AKAV Ⅰb基因亚群存在的第1份报告[30]。2017年,伊拉克通过ELISA方法对出现流产、AH综合征等犊牛进行检测,发现其有较高的AKAV抗体水平[31],证实这些犊牛发病是由AKAV感染所引起的。随后进行AKAV抗体阳性动物筛查发现土耳其、以色列等国均有感染。目前所报道的在西亚地区的AKAV属于基因群Ⅰ。

1.2.2AKAV在非洲地区的流行 1976年,首次发现非洲国家存在AKAV。在采自肯尼亚沿海森林的不吉按蚊(Anophelesfunestus)中分离到1株AKAV,命名为MP496(AB232320),属于基因群Ⅳ[32];1985年,在津巴布韦的库蠓中分离到4株AKAV[33]。1985年,通过对采自肯尼亚境内的山羊、绵羊、牛以及野生反刍动物的血清进行中和试验发现,多种动物中检出AKAV抗体,从而证实赤羽病在肯尼亚地区的流行。1987年,对采集自南非、肯尼亚、乌干达等11个撒哈拉沙漠以南的非洲国家的41种野生动物的血清进行中和试验,证明在25种野生动物中检测出AKAV中和抗体,且AKAV在11个国家中均有分布[34]。2016年,OLUWAYEIU等[35]检测2012-2014年采集的尼日利亚的牛和绵羊血清,AKAV抗体阳性率高达91.2% 和65.4%。截止到目前,有关与非洲地区的毒株的基因分群资料较少,以Kenya1972为代表的毒株属于基因群Ⅳ。

1.2.3AKAV在大洋洲地区的流行 1968年,在澳大利亚的牛中分离到名为B8935(MH734940)和R7949(MH734959)的2株病毒,属于基因群Ⅲ。1974-1979年,澳大利亚的新南威尔士洲发生2次由AKAV引起的新生牛AH综合征[36]。随后经调查研究发现,在澳大利亚西澳洲、北领地、南澳州等多地均发现AKAV血清抗体阳性动物[37],因此证实AKAV流行于整个澳洲。这些抗体阳性动物有牛、山羊、绵羊、骆驼、鹿、马和犬。经过分析,澳大利亚分离毒株与亚洲和非洲分离毒株属于不同的基因群,为基因群Ⅲ,说明澳大利亚本土AKAV较为复杂。

1.3 临床症状通过已有研究可知牛、绵羊、山羊等家养和野生反刍动物及猪、小鼠、豚鼠、竹鼠等均可感染AKAV。其中,在自然感染条件下,从有神经症状的竹鼠[19]和无症状的猪[38]中都有分离到AKAV的报道。

1.3.1牛 牛是AKAV的自然宿主,发病率为5%～50%,多数的毒株感染非怀孕牛后,表现为亚临床感染,没有临床症状,但病毒感染后会有短暂病毒血症,一般不超过9 d。少数毒力强的毒株感染犊牛和成年牛后会出现脑炎症状,表现为眼球震颤、共济失调、跛行等。产后母牛一般没有临床症状,但会因胎儿关节弯曲导致难产,造成产道损伤引起不孕或母牛死亡等。在出现病毒血症后3～4 d即可产生抗体。病毒感染后的临床症状与病毒感染时的妊娠期具有直接的关系,妊娠早期(妊娠前1/3感染,76～104 d),出生牛主要表现为积水性脑脊髓炎,犊牛能自行站立行走,但许多牛出现失明、耳聋、精神沉郁、呆滞等临床症状,没有哺乳动作或缓慢;妊娠中期(妊娠中1/3感染,103～174 d),出生时关节弯曲,肌肉萎缩,斜颈脊柱弯曲等;妊娠后期(妊娠后1/3感染,180 d～出生),机灵、警觉,但无法站立,共济失调、肌肉萎缩。不同型病毒感染后,也会有不同的临床表现,Ⅱ型基因群的毒株仅引起怀孕动物的繁殖障碍,但基因群Ⅰ的毒株还可导致犊牛和成年牛脑脊髓炎[39],如小牛通过脑内感染属于基因群Ⅱ的JaGAr39和OBE-1毒株,只引起轻微的神经症状或没有引起神经症状。犊牛感染基因群Ⅰ毒株 Iriki株会产生严重的神经症状[40]。这也表明,基因群Ⅰ中的毒株的神经毒力比基因群Ⅰ中的毒株强得多。

1.3.2羊 羊也可以感染AKAV,发病率为15%～80%,妊娠期山羊和绵羊感染AKAV后,由于妊娠期较短,导致易感期较短,病毒通过血液进入胎盘,导致胎儿感染,出现流产、早产、死产的现象,若胎儿顺利产下,一般会有中枢神经系统的变化如脑脊髓炎、小头畸形等和不同程度的关节弯曲和脊椎畸形如斜颈、脊椎弯曲[3],羔羊很快就死亡。在AKAV流行区域,初生羊在母源抗体下降后就受到AKAV感染[41-42]。大多数AKAV感染非妊娠期的羊后没有临床症状,仅有少数发生变异的AKAV(如:Iriki株)被认为可以感染成年动物,并引起脑脊髓炎等神经症状。

1.3.3实验动物 小鼠常用作AKAV的神经毒力研究模型动物[43],AKAV感染小鼠后,小鼠出现后腿瘫痪、脑出血,同时伴随共济失调、癫痫等症状。有研究表明,用Iriki株对1周龄小鼠腹腔注射,小鼠出现神经症状甚至死亡,脑内可检测到抗原,而用OBE-1毒株感染小鼠,却没有任何临床症状。小鼠通过脑内接种Iriki株死亡,而接种OBE-1株小鼠存活,但脑内能检测到抗原[44]。OBE-1毒株主要通过感染胎儿导致流产和先天畸形,而Iriki毒株毒力更强,会导致新生牛患非化脓性脑脊髓炎[45]。

乳鼠腹腔接种93FMX株和K0505株(与OBE-1株有亲缘关系),没有出现临床症状,存活率为100%。而大多数接种AKAV-7/SKR/2010或AKAV-17/SKR/2010(与Iriki株有亲缘关系)毒株的乳鼠表现出明显的临床症状,表明这2种毒株对乳鼠的神经毒力比93FMX和K0505毒株更强[46]。同时也表明,基因群Ⅰ毒株的神经毒力显著高于基因群Ⅱ毒株。

1.3.4其他动物 自然感染AKAV的竹鼠在嘴唇、鼻子等裸露的皮肤、腿部出现红斑以及爪垫裂缝,肌肉失去灵活性、无力,后腿迅速瘫痪。这些患病竹鼠的常见病变还包括脑、肺脏和肾脏出血、肝脏颜色变化和脾梗死。而且所有患病竹鼠都有相似的组织学表现如中枢神经组织和脑膜中的非化脓性脑脊髓炎和单个核细胞在血管周围的浸润,脾出血和坏死等症状[19]。

鸡胚在孵化6 d后通过卵黄囊途径感染AKAV,最先出现在中枢神经系统的病变是坏死性脑炎。5～7 d,视叶中室管膜细胞变性,在大脑半球的新纹状体已形成空洞。9～15 d,胚胎大脑半球新纹状体缺失。鸡胚在孵化15 d后通过静脉感染AKAV,3～6 d出现脑炎灶,表现为神经元变性、神经胶质细胞增生和异嗜性细胞浸润。感染后11～15 d的胚胎有生长迟缓的迹象并明显消瘦[45]。

该病主要通过蚊、库蠓等吸血昆虫叮咬传播,一般不能通过直接接触感染。因此,AKAV的传播与该区域内是否存在适宜的宿主以及传播媒介有关。牛、绵羊、山羊易感,马、骆驼、鹿等也可感染,病毒感染后带毒时间一般为1～9 d。在疫病流行区,病例一般较少,呈零星散发。如果有良好的虫媒生活环境,如充沛雨水和适宜温度、从疫区迁移感染易感动物则疫病容易暴发。该病毒的传播具有明显的周期性和季节性,有研究发现,AKAV在以色列同一区域内周期性地暴发3次[47]。而在澳大利亚,AKAV的传播随着季节的变化而变化。在温度和湿度较高的夏季最为活跃,而在温度较低的冬季则几乎消失[48],这与气候条件是否适宜媒介昆虫的生长和繁殖有关。同时本病具有明显的地域性,不同地域毒株的基因型、毒力差异显著。

病毒经胎盘感染胎儿,病毒感染胎盘的内皮细胞和滋养层细胞,达到足够滴度后穿越胎盘感染胎儿。妊娠早期感染:病毒感染导致增生的纤维组织阻塞了脑脊液的循环孔道,导致脑积水,压迫大脑发育,导致大脑发育小或无脑。妊娠中期感染:大脑发育初步或基本形成,病毒侵染脑神经,导致继发性肌肉和软组织改变,肌肉出现失神经支配改变,肌肉萎缩、变性和纤维化,软组织出现挛缩性改变,支配感觉的神经发育正常。妊娠后期感染:大脑发育基本形成,但病毒可能感染脑、脊髓和骨骼肌,导致共济失调,症状较轻。

3.1 防控现状赤羽病可通过疫苗免疫和场内灭蚊虫等进行防制。日本、韩国和澳大利亚等广泛使用疫苗用于赤羽病的防控,国内尚无疫苗可用。

3.1.1疫苗免疫 疫苗接种是AKAV防控的最佳途径。目前,已成功研制出了活疫苗和灭活疫苗。日本于20世纪70年代末研发出赤羽病灭活疫苗,该疫苗是用福尔马林灭活病毒制备而成,具有良好的安全性,对怀孕动物安全,可用于妊娠动物的紧急免疫接种。疫苗免疫后,牛可产生较高的抗体效价,能有效保护牛产生病毒血症和胎儿感染。用疫苗免疫动物2次,间隔4周,保护期为12个月,每年注射1次可达到良好的保护效果[49]。

将AKAV OBE-1株在细胞中连续传代而致弱制成的减毒活疫苗也具有良好的保护力。将强毒接种HmLu-1细胞,在30℃低温环境下连续20次传代并克隆纯化获得减毒疫苗株。与OBE-1株相比,它对乳鼠的外周感染性和对3周龄小鼠的脑内感染性均低得多。当用该疫苗接种牛时,可诱导产生较高滴度的中和抗体,而且没有出现发热、白细胞减少或病毒血症等症状。该疫苗毒株具有较好的安全性,不会在接种动物的器官或胎儿中发生毒力返强;同时该疫苗还可防止牛胎儿受到AKAV的感染[50]。然而,该疫苗不推荐在羊中使用,因为在怀孕母羊接种该疫苗后,可引起病毒血症,通常引起胎儿子宫内感染。

KIM等[51]用二乙烯亚胺或福尔马林作为灭活剂,研制出了Aino、Akabane和Chuzan病毒的三联灭活疫苗。该疫苗在小鼠、豚鼠和牛等动物体内进行了安全性和效力研究,二次免疫后2周内即可产生明显的免疫应答,未见任何副作用。该疫苗的现场应用也显示了接种牛的抗体增加,可以用于控制反刍动物的虫媒病毒感染。

3.1.2传播媒介的控制及易感动物的管理 控制传播媒介在AKAV感染的高发地区可产生较好的效果,然而对传播媒介的控制具有很大的局限性,因为目前所了解到的传播媒介生物较少,并且非常难以实现对传播媒介蚊虫的绝对控制,一旦易感动物被携带病毒的蚊虫叮咬就会造成感染。目前,控制传播媒介的方法有消除或减少病媒滋生点,如直接用杀虫剂杀灭成年病媒或及时对潮湿的有机富集土壤或大型食草动物粪便进行处理等;也可通过管理易感宿主使其免受病媒的叮咬如使用驱虫剂、防虫网、网孔筛等实现动物活动场所封闭而减少感染。

但是,传播媒介的控制措施通常是在短期内可取得较好的效果,而对于预防胎儿免受病毒感染的效果并不显著。为了减少AKAV感染造成的影响,首先要避免在媒介蚊虫活跃的季节使易感妊娠动物进入病毒流行的地区,其次可以通过避开传播媒介的活动高峰将配种时间或将产仔期由春季改为秋季,从而预防该疾病的暴发。

3.2 防控建议为降低AKAV被携带进入我国的风险、防止媒介昆虫的传入,要加强对进口产品的检验及核查、入境活物的检疫,加强防疫消毒工作,将本病阻挡于国门之外。时刻关注国外疫情,及时暂停与疫病暴发区的贸易往来。为了达到消除传播媒介,阻断疫病传播的目的,要对畜舍内进行定期消毒,杀灭蚊子、库朦等吸血昆虫。加强牧场血清抗体监测,充分了解当地赤羽病流行动态,对于疫病流行区域,严密关注当地近几年降雨情况,预判疫病流行情况。加强灭蚊蝇生物制剂、疫病诊断试剂和疫苗研发。

在我国畜牧业生产中牛、羊养殖占有重要地位,随着养殖业的发展,赤羽病引起的经济损失不容忽视。同时我国与世界各国的贸易往来日渐频繁,这也加大了我国赤羽病暴发的风险。由于赤羽病的传播方式和特征,导致该病在易感动物中的传播初期难以得到有效控制;而且该病分布范围广,病毒新变异体的出现,给该病的诊断防控带来困难。综上所述,赤羽病应得到更多的重视,在加强流行病学调查的基础上,加快疫苗的研发,结合防治措施控制该病在畜牧业的流行,减少其带来的经济损失。

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