发酵豆制品中生物胺的产生及控制研究进展

刘旭，王军，课净璇，马艳莉，*，席晓丽，王印壮，谷晓东

（1.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071000；
2.南阳理工学院张仲景国医国药学院，河南 南阳 473004）

发酵豆制品是以豆类为主要原料，经过微生物发酵，再经调配制成的具有特殊风味和形态的食品或调味品。中国的传统发酵豆制品包括酱油、豆豉、豆酱和腐乳4大类[1]。豆制品作为一种重要的蛋白质来源，受到中国、日本和韩国等亚洲国家人民的青睐。豆制品在发酵过程中会发生一系列生物化学变化，一些难降解的物质会转变为易于被人体吸收的营养成分[2]，且发酵过程中还产生许多新的功能性物质，如活性肽、不饱和脂肪酸、大豆异黄酮以及不同种类的维生素等[3]。相关研究证明，发酵豆制品有许多的健康益处，包括抗癌、调节葡萄糖摄取、溶栓、促进消化和调节肠道菌群等功能。但有害菌可能在发酵过程中产生潜在的毒性代谢物，如生物胺（biogenic amines，BAs）等[4]。

BAs是一种具有生物活性的低分子碱性含氮有机化合物，存在于含有高蛋白质或游离氨基酸且受微生物或生物化学活性影响的食物中[5]。根据来源可分为内源性BAs和外源性BAs[6]，内源性BAs一般存在于水果等食物中，作为机体调节剂在细胞合成和维持细胞膜稳定中发挥作用；
外源性BAs主要存在于发酵食品中。根据结构特点可以将BAs分成3类[7]，分别为脂肪族（尸胺、腐胺、精胺、亚精胺）、芳香族（β-苯乙胺、色胺）和杂环族（组胺、酪胺），根据胺基的数量，可分为单胺（酪胺、苯乙胺）和二胺（组胺，腐胺、尸胺）。BAs在细胞生长代谢中发挥着重要的生理作用[8]，少量摄入时能够提高新陈代谢水平，促进生长发育、抗氧化和延缓衰老等，但当摄入的BAs达到一定量时就会对身体造成伤害，例如过量酪胺会引起头痛和血压升高。组胺被认为是毒性最强的胺[9]，高浓度的组胺会导致恶心、偏头痛和心脏问题[10]。

目前我国尚未建立有关发酵豆制品中BAs含量的限量标准，一些国家对水产品等食品中BAs的限量进行规定，但各国的限量标准也不统一。美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）规定，水产品中组胺浓度不得超过50 mg/kg，酪胺含量不得超过100 mg/kg，在其他食品中组胺最高限量为50 mg/kg[11]。欧洲食品安全机构（European Food Safety Authority，EFSA）规定食品中组胺限量为 100 mg/kg[12]。我国国家标准只规定了鱼类中的组胺含量，高组胺鱼类如鲐鱼、金枪鱼和沙丁鱼中组胺限量为400 mg/kg，而在其他海水鱼类中，组胺限量规定为200 mg/kg[13]。此外，BAs在亚硝酸盐存在条件下还可能转化为潜在的致癌物N-亚硝胺[14]。发酵豆制品中的BAs问题较为严峻，因此要进一步改进发酵工艺控制BAs的产生，进一步提高发酵豆制品的食用安全性。

1.1 发酵豆制品中BAs含量

发酵豆制品在中国有悠久的历史，现阶段市场上常见的发酵豆制品主要包括腐乳、豆豉、豆酱、酱油、纳豆和韩国清谷酱等。大豆中含有丰富的蛋白质，在发酵过程中蛋白质在蛋白酶的作用下水解产生氨基酸、多肽等物质，氨基酸在氨基酸脱羧酶的作用下生成BAs，含量超标可能会带来食品安全问题[15]。不同的发酵豆制品中BAs含量不同，具体含量如表1所示。

腐乳是以大豆为原料，经过研磨、制坯、前发酵、盐腌、后发酵等加工工艺制成的调味品[16]。Liang等[17]研究了腐乳发酵过程中菌落演替和代谢产物的变化对BAs的影响，结果表明，发酵末期总BAs含量最高，且作为毒性最强的BAs，组胺含量为210.53 mg/kg，含量占总BAs的40%以上。Li等[18]通过检测国内市场中6类腐乳样品BAs含量发现，青方腐乳中组胺含量为616.28 mg/kg，明显高于其他类型腐乳，食用后可能会对人体产生危害，因此不适宜每天过量食用腐乳。

酱油作为调味料在日常烹饪中发挥着重要作用，并且在韩国、日本和韩国广受欢迎。Lu等[19]检测了40种不同生产厂家的酱油，酪胺的检出率最高为97.5%，其次为亚精胺（95%）、组胺（92.5%）、尸胺（82.5%）和精胺（80.0%）。不同厂家酱油中BAs含量不同可能与生产工艺和发酵方式有关。

豆豉是将大豆蒸熟后接种毛霉、米曲霉或根霉等发酵剂，然后经过盐处理和后发酵过程制作而成。豆豉不仅蛋白质、脂肪和碳水化合物含量丰富，还含有多种生物活性物质（如豆豉纤溶酶和大豆异黄酮等）。Gong等[20]利用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定豆豉中 BAs，在豆豉中检测到3种BAs，分别为色胺、腐胺和尸胺，其中含量最高的为尸胺。另外，淡豆豉作为我国一种传统药食两用的中药材，富含大豆异黄酮和γ-氨基丁酸，具有解表、除烦、宣发郁热的功能[21]，但对其BAs含量的报道较少。

豆瓣酱的发酵过程一般分为豆瓣预处理、制曲和加盐发酵等多个阶段。朱天傲等[22]测定12种市售豆酱中BAs的含量，结果表明，豆酱中的精胺、β-苯乙胺、酪胺平均含量最高，BAs总体差异较小。曾雪晴[23]的研究发现，腐胺、尸胺、组胺及酪胺是豆酱中主要的BAs，占BAs平均总量的76.4%。

纳豆是经过枯草芽孢杆菌发酵的一种传统功能性食品，营养价值高，因其具有预防心血管疾病的功效在日本较受欢迎。Kim等[24]的研究发现，在21种纳豆产品中，β-苯乙胺和酪胺含量较高，其中有9种产品超过限量值，但总BAs含量均没有超过有害水平（1 000 mg/kg）。纳豆中BAs含量不仅受微生物的影响，还受原料的影响，但微生物的影响更大。

清谷酱是韩国传统的发酵豆制品，具有很高的营养价值。Jeon等[25]对韩国清谷酱60个样品中的BAs进行分析，结果表明，β-苯乙胺和酪胺含量较高，因此在清谷酱发酵过程中要注意控制酪胺的形成。不同发酵豆制品由于其发酵环境、发酵菌株和制作工艺等因素不同，导致BAs的含量差异较大。由于原料不同，商品运输和储存条件不同，导致检测的发酵豆制品中BAs的含量情况不同[26]。食用过量的发酵豆制品有可能会引起BAs中毒，对身体造成伤害，因此在将发酵豆制品作为调味料时不宜过量使用。

1.2 BAs形成机理

BAs在生物体内主要是由氨基酸脱羧或酮和醛的胺基化和转氨作用形成[27]。发酵豆制品中BAs主要是组胺、色胺、β-苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺和亚精胺，分别由脱羧酶特异性的作用于组氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸和鸟氨酸而形成[28-29]，具有产脱羧酶能力的微生物有芽孢杆菌、假单胞菌、大肠杆菌和沙门氏菌属的病原体[30]。氨基酸脱羧有2种机制，一种是以5-磷酸吡哆醛为辅酶[31]，另一种则是利用丙酮酰基团辅助氨基酸脱羧酶，将氨基酸中相应的羧基脱去形成对应的胺。影响食物中BAs形成的3个因素：作为BAs前体物质的游离氨基酸含量；
产氨基酸脱羧酶的微生物的生长；
产胺微生物的适宜生长条件。食品中已经存在的BAs可以用单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）降解来减少BAs对食品的危害[32-33]。

1.3 BAs的检测方法

目前，BAs的检测方法主要有HPLC法、液相色谱质谱联用法、气相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法和离子色谱法等。HPLC法具有检测快速、灵敏度高的特点，是应用较广泛的定性、定量检测方法。李大伟等[34]以丹磺酰氯作为衍生剂，利用HPLC法检测市售腐乳中的BAs含量，结果表明，8种主要的BAs能较好分离，并且定量限在0.60μg/g～1.83μg/g，灵敏度较高。Gil等[35]采用HPLC结合电位检测法检测酒精饮料中的10种BAs，测定准确度为86.4%～109.9%，该方法可以在25 min内检测出10种BAs。Zhang等[36]利用液相色谱-质谱联用法建立了豆制品等食品中6种BAs的快速检测方法，结果表明，6种BAs的定量限为0.25 mg/kg～2.50 mg/kg，该方法无需进行衍生。Kamankesh等[37]利用电膜萃取和微萃取-气相色谱-质谱联用法测定鱼罐头中的BAs，发现腐胺、酪胺、组胺和尸胺的检出限分别为 0.03、0.11、0.06、0.29 ng/g，该方法排除了样品基体的干扰，提高了灵敏度，此方法可以准确、可靠的测定鱼罐头中BAs，也可用于测定其他食品样品中的BAs含量。薄层色谱法操作简便，不需要昂贵的设备，可以对多个样品进行分析。Kounnoun等[38]使用丹磺酰氯作为衍生剂对鱼类产品中组胺进行薄层色谱分析，测得回收率为93%～105%，检测限为4.4 mg/kg，定量限为10.5 mg/kg，与高效液相检测结果一致。

离子色谱法常用于阴、阳离子的分析，BAs是最弱离子，因此，可以用离子色谱法进行检测[39]。Palermo等[40]利用离子色谱法和电导检测方法检测BAs，该方法分辨率和分离率较好，其检出限为 23 μg/kg～65 μg/kg，加标空白样品的定量限为65 μg/kg～198 μg/kg，并通过对葡萄酒、奶酪和金枪鱼罐头等真实样品的分析，验证了该方法具有较高的可行性。毛细管电泳分析速度快、分辨率较高，但与HPLC相比，其浓度检测限较高。Mantoanelli等[41]利用丹磺酰氯对BAs进行衍生，利用毛细管区带电泳对BAs衍生物进行分离，测得BAs的检出限为7 μg/L～50 μg/L。BAs检测方法如表2所示。

表2 BAs检测方法Table 2 The analytical methods for the determination of BAs

续表2 BAs检测方法Continue table 2 The analytical methods for the determination of BAs

2.1 发酵菌种

豆制品在发酵过程中BAs的累积主要与微生物的生长有关，具有产脱羧酶能力的微生物可以促进BAs的积累[42]。Gardini等[29]从腐乳中分离出59株产胺菌株，其中接种热带芽孢杆菌（Bacillus tropicus）主要产生组胺、色胺和尸胺，接种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）进行发酵产生酪胺和色胺。Kung等[43]测定了40种市售味增样品中组胺含量并筛选了产组胺微生物。研究发现，所有BAs含量小于21.6 mg/kg，并分离出一株巴氏杆菌（Bacillus pasteuri）、一株枯草芽孢杆菌（Bacillus sp）、两株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、两株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、两株大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）为产胺菌株。Tsai等[44]测定了26种市售豆豉样品中的BAs并分析了产组胺菌株，结果表明，豆豉中大多数样品的组胺含量大于50 mg/kg，超出FDA的标准限量值，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）为组胺产生菌。朱天傲[45]测定了市售蚕豆豆酱中的BAs，并从豆酱中分离出64株潜在BAs产生菌株，其中6株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）能够生成组胺，最高含量达到16.23 mg/L。因此接种具有较高产胺能力的菌株可能会产生较多的BAs，为发酵豆制品中BAs的积累创造了条件。不同种类发酵豆制品中产胺微生物见表3。

表3 不同种类发酵豆制品中产胺微生物Table 3 The different types of amine-producing microorganisms in fermented soybean products

2.2 pH值

pH值是影响发酵豆制品中BAs的重要因素，pH值可以通过影响微生物的生长，抑制酶的活性来影响BAs的产生[46]。在一定范围内，pH值是影响微生物生长、降低氨基酸脱羧酶活性的重要因素，调节底物pH值是控制食品中BAs生物合成的重要途径。在发酵过程中蛋白质降解使pH值降低，碱性氨基酸为抵抗酸性环境，在微生物产生的脱羧酶作用下脱羧转化成BAs[47]。Yang等[48]研究了从酸鱼中筛选出27株高产胺菌株的基因多样性和pH值对菌株的影响，结果表明，在pH值为6.0时，腐胺产量最低，组胺产量最高，在pH值为4.5时，2种单一底物的腐胺总量高于混合底物的腐胺总量。pH值可以通过影响微生物的生长和氨基酸脱羧酶的活性来影响形成的BAs的类型和能力。因此，在酸性环境中会产生较少的BAs。

2.3 温度

温度是影响BAs积累的关键因素，温度对腐乳中BAs含量有明显影响[49]。温度主要是通过影响微生物生长代谢和酶的活性来影响BAs的积累。在低温下，发酵和贮藏降低了组胺、酪胺、腐胺、尸胺等的积累，这种减少可能是由于低温使脱羧酶活性降低，但它们的含量随着温度的升高而增加[50]。Li等[51]的研究发现，在4、25、37℃中储存腐乳，BAs含量为29.17 mg/kg～49.32 mg/kg、47.10 mg/kg～49.32 mg/kg、49.32 mg/kg～52.68 mg/kg，随着温度升高呈现上升的趋势，可能是由于高温将腐乳中的氨基酸分解成BAs。Sun等[52]研究不同发酵剂对发酵羊肉香肠在4℃和20℃保存中的BAs含量影响，发现发酵香肠中主要BAs为酪胺，贮藏期间浓度为8.02 mg/kg～229.88 mg/kg，酪胺含量在4℃贮藏中呈下降趋势，保存温度为20℃时随着贮藏时间的延长含量不断增加，20℃贮藏高于4℃贮藏时BAs含量，当温度较高时，酪氨酸在发酵香肠中的积累较多。

2.4 混合调味料

在后发酵时加入的混合调味料也对发酵豆制品中BAs含量有一定影响。混合调味料可以通过抑制产胺微生物的生长和降低氨基酸脱羧酶的活性来减少BAs的积累。Lee等[53]研究在发酵豆酱的不同生产工艺和贮藏阶段添加儿茶素和葡萄柚籽提取物对BAs的影响，结果表明，在发酵前添加3 g/kg儿茶素，BAs含量减少了29%，并且在贮藏前添加300 mg/kg葡萄柚籽提取物，豆酱在贮藏40 d后BAs总量下降大约5%，可能是因为添加剂抑制了氨基酸脱羧酶的活性。Qiu等[54]的研究发现，在腐乳后酵过程中添加乙醇的试验组BAs含量极显著低于未添加乙醇的对照组，乙醇对蛋白质水解和微生物活性的抑制作用是减少BAs产生的原因。Li等[55]研究了在腐乳后发酵时加入含有不同调味料对BAs的影响，结果表明，在后酵时加入2%的生姜粉对腐乳中组胺、酪胺和总BAs具有较好的抑制效果。Mah等[56]测定了生姜、大蒜等香料对韩国发酵鳀鱼中BAs的影响，结果表明，大蒜提取物对BAs产生的抑制作用较强，腐胺、尸胺、组胺、酪胺和亚精胺的含量分别降低了11.2%、18.4%、11.7%、30.9%和17.4%。Li等[57]研究了不同盐浓度对酱油酿造过程中的BAs含量的影响，结果表明，在添加16%、19%和22%NaCl的酱油中，随着NaCl浓度的增加，酱油中腐胺、组胺和尸胺的含量明显降低，表明NaCl会通过影响发酵时的高渗透压抑制产胺微生物的生长繁殖，破坏细菌细胞膜上的氨基酸脱羧酶。Chin等[58]在味增发酵过程中添加了5%和10%盐，发现含有较低盐的味增中BAs含量明显高于高盐味增。因此，加入不同的混合调味料可以影响产胺微生物的生长，从而减少BAs的积累，在进行豆制品发酵时要选择合适的混合调味料。混合调味料添加对BAs形成影响见表4。

表4 混合调味料添加对BAs形成影响Table 4 The effect of mixture on BAs formation

根据影响BAs产生的因素可以从以下3个方面来减少食品中的BAs含量：1）控制产胺微生物，选择合适的发酵剂；
2）控制氨基酸脱羧酶的活性，优化发酵条件和添加适当的食品添加剂；
3）降解BAs，在发酵时接种降胺微生物。

3.1 选用不产胺的发酵菌株

选择不产氨基酸脱羧酶的发酵剂来进行发酵，可以从源头上控制BAs的含量。Tan等[59]研究了6种不同发酵剂快速发酵豆豉，结果表明，在最终的豆豉产品中只含有腐胺和亚精胺，且总BAs含量为22.47 mg/kg～40.95mg/kg，其中雅致放射毛霉产生BAs较少。Lan等[60]研究了单一菌株和复合菌株对纳豆中BAs的影响，结果发现毛霉发酵降低了除组胺外的BAs含量，3株菌株发酵的纳豆中腐胺和组胺含量有所增加，但其他BAs含量降低，特别是亚精胺和精胺，因此纳豆中总BAs含量降低。Yang等[61]研究3种纯种发酵剂雅致放射毛霉（Actinomucor elegans）、五通桥毛霉（Mucor wutunkiao）和总状毛霉（Mucor racemosus）发酵腐乳中BAs的变化，结果表明，不同的发酵菌株和发酵工艺对腐乳中BAs含量有不同的影响，总状毛霉发酵腐乳产生的尸胺、亚精胺、精胺、组胺和酪胺水平显著低于其他毛霉菌株混合发酵产生的BAs。Fong等[62]采用鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus GG）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei Shirota）和大肠埃希菌（Escherichia coli Nissle 1917）对黑豆进行发酵，结果显示，在豆豉样品中均未检测到酪胺，发现发酵过程中使用的菌株是决定发酵食品中BAs含量的关键因素，培养期间的温度和氧气的存在对BAs的生成是至关重要的。Sun等[63]研究发现用木糖乳杆菌（Staphylococcus xylosus）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）混合接种干香肠，尸胺、腐胺、色胺、β-苯乙胺、组胺和酪胺6种BAs的积累减少，其中2种菌的混合发酵BAs产生最少，且BAs浓度与肠杆菌数具有良好的相关关系，部分BAs与乳酸菌数呈负相关。因此，筛选出不产胺微生物，将发酵菌株进行优化后进行接种发酵，能够抑制BAs的产生，可以从源头上对BAs的含量进行控制。

3.2 抑制氨基酸脱羧酶活性

氨基酸脱羧酶是微生物产生BAs的必要条件之一，影响氨基酸脱羧酶活性的因素包括pH值、温度、盐的浓度等。pH值是影响氨基酸脱羧酶活性的重要因素，pH值较低时，氨基酸脱羧酶的活性也会受到抑制，氨基酸脱羧酶的最适pH值为4.0～5.5[38]。Kim等[64]研究贮藏温度和时间对韩国米酒中BAs的影响，结果表明，在4℃条件下贮藏30 d仅检测出少量腐胺，而20℃贮藏3、5、7 d均发现酪胺、组胺、苯乙胺、腐胺、尸胺的产生。Kim等[65]研究发现微生物在高盐浓度下会产生较少的BAs，这是由于豆酱在高盐环境下具有更高的渗透压，微生物的生长受到抑制。因此，可通过优化发酵条件，降低氨基酸脱羧酶活性，减少BAs的产生。

3.3 接种降解BAs发酵菌株

Zaman等[66]从鱼酱中分离出具有胺氧化酶活性的肉葡萄球菌 FS19（Staphylococcus carnosus FS19）和解淀粉芽孢杆菌 FS05（Bacillus amyloliquefaciens FS05），并将其分别作为发酵剂进行鱼酱的发酵，结果表明，产品中组胺浓度分别降低了27.70%和15.40%。Kim等[67]在进行韩国清谷酱发酵时选择了4株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），结果表明，利用地衣芽孢杆菌发酵的试验组中7种BAs的含量显著降低，并且产胺菌株蜡样芽孢杆菌的生长也受到抑制。程淑敏等[68]将2株在培养基中具有较高BAs降解能力的菌株Wickerhamomyces anomalus和Miller-ozyma farinosa作为发酵剂进行酱油发酵，结果表明，2株菌对BAs生成均具有一定的抑制效果，Wickerhamomyces anomalus在组胺、酪胺和亚精胺的降解方面优于Millerozyma farinosa。马宇霞等[69]从44种熏马肠中分离筛选出6株具有BAs氧化酶活性的菌株，分别为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），并将它作为发酵剂加入熏马肠中验证降胺能力，结果表明，这些菌株明显降低了组胺、酪胺、腐胺和尸胺的含量，可将6株菌株用于肉制品的发酵中。筛选具有降解BAs作用的微生物，并将其应用于发酵体系，是控制食品中BAs的合成和累积、减少食品中BAs含量的有效方法，对提高发酵豆制品品质和安全性具有重要意义。不同微生物对BAs降解作用见表5。

表5 不同微生物对BAs降解作用Table 5 The degradation of biogenic amines by different microorganisms

发酵豆制品在我国有近两千年的历史，豆制品的发酵过程是在多种条件如发酵菌种、微生物菌群结构、发酵条件、原料和环境等共同作用下进行的，微生物代谢产生BAs，可能带来食品质量安全隐患。目前发酵豆制品中BAs还没有限量标准，需要根据人均发酵豆制品日摄入量和各国常用的不同类型发酵食品中BAs含量的信息，制定发酵豆制品中BAs的限量标准。一些研究对BAs的控制主要集中在改变发酵菌株，如使用一些不产胺或能降解BAs的菌株和优化发酵条件等方面，对不同发酵豆制品中BAs的形成原因、微生物菌群和BAs含量之间关联机制、发酵过程中BAs变化规律还需要进一步研究。在今后的研究中，需要考虑发酵时间、pH值和温度等环境因素的影响，并将发酵豆制品的生产过程进行标准化，达到抑制发酵豆制品中BAs产生的作用，提高发酵豆制品的食用安全性，推动发酵豆制品行业高质量健康发展。

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