人卵丘颗粒细胞及胚胎培养液中线粒体的研究进展

甄雪蓉，贾俊龙，王玲，*

(1.甘肃中医药大学第一临床医学院，兰州 730000；
2.中国人民解放军联勤保障部队第九四○医院生殖医学中心，兰州 730050)

全世界约有15%的夫妇受到不孕症的影响，先天缺陷、营养不良、激素失调或生殖系统疾病等多方面因素均可导致不孕不育[1]，辅助生殖技术(ART)的出现改善了这一局面。人类ART主要有常规体外受精-胚胎移植(IVF-ET)、人工授精、卵子体外成熟(IVM)、卵胞浆内单精子注射(ICSI)、胚胎冻融技术、植入前遗传学诊断(PGD)等。但有一部分患者在ART治疗之后，妊娠率仍不理想。研究表明，存在于成熟的人类卵母细胞中的数十甚至数十万个线粒体，是卵母细胞成熟及成功植入前胚胎发育的必要条件[2]。颗粒细胞的线粒体参与众多细胞内物质代谢，可利用葡萄糖的代谢产物丙酮酸为卵母细胞三磷酸腺苷(ATP)合成提供底物[3]。颗粒细胞线粒体功能及颗粒细胞-卵母细胞间的相互作用是卵母细胞正常发育的必要条件[4]。近年来，因为ART术后妊娠率的不理想及其发展瓶颈，学者们对人类胚胎培养液中线粒体功能的研究愈来愈多，本文就人卵丘颗粒细胞(CGCs)及胚胎培养液中线粒体的研究进展展开综述。

1.线粒体结构：线粒体由两层磷脂膜包裹，即线粒体外膜和线粒体内膜，位于两层线粒体膜之间的是线粒体膜间隙，被线粒体内膜包裹的是线粒体基质[5]。这两层膜在脂质组成、跨膜蛋白特征和作用、通透性和形状等方面存在显著差异，是细胞器内共生起源的结果。线粒体协调许多细胞过程，例如脂质代谢、细胞离子稳态以及金属辅助因子的生物合成。线粒体超微结构的复杂性决定了其功能的多样性[6]。

2.线粒体功能：众所周知，线粒体是细胞的动力源，主要通过氧化磷酸化合成ATP，ATP合成过程中通过电子传递链(ETC)传递电子。ETC由5个复合体(I-V)组成，通过调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和琥珀酸的转移，促使线粒体内膜产生电化学梯度来驱动ATP合成酶。氧化磷酸化过程可产生活性氧(ROS)，生理情况下，ROS的产生和清除维持在一个动态平衡[7]。高浓度ROS会损伤线粒体功能，生理水平的ROS作为信号分子，通过调节细胞内的信号传导介导细胞分裂、细胞分化和细胞功能转变等诸多生物学过程，从而维持细胞和组织稳态[8]。在卵母细胞成熟和早期胚胎发育过程中，线粒体经历了阶段性的空间再分布，线粒体的结构缺陷和DNA拷贝数的异常都可能影响卵母细胞的成熟和胚胎的发育。线粒体与细胞核以及其他细胞器之间的通讯，成为其调节着床前发育的关键[9]。

1.CGCs：人体内卵泡的发育是一个复杂的过程，从始基卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡、排卵前卵泡直至排卵，共经历了5个阶段。颗粒细胞分为位于卵泡壁的壁层颗粒细胞(MGCs)和直接包裹在卵母细胞周围的CGCs。CGCs与卵母细胞直接接触形成卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，主要为卵母细胞提供营养和能量；
而MGCs位于卵泡壁上，主要执行内分泌功能，排卵时卵细胞和它周围的CGCs一起被排出。研究发现，在行ICSI周期中，若获取的卵母细胞少或未完全成熟，可以将未成熟卵母细胞与CGCs一起体外共培养，此法可提高患者优质胚胎率[10]。CGCs和MGCs在卵泡的生长发育中都起着重要作用[11]。

在卵泡发育过程中，CGCs通过缝隙连接参与和卵母细胞的双向代谢物交换，这对卵母细胞的正常成熟和CGCs的增殖都至关重要。另一方面，卵母细胞旁分泌因子如转化生长因子家族成员(GDF9、BMP15)控制和调节卵丘的生长和扩张[12]。GDF9、BMP15存在于与单卵母细胞相对应的CGCs中。研究表明，两者的mRNA基因表达水平与正常受精率、优质胚胎率和优质囊胚形成率呈显著正相关，因此，可以作为预测卵母细胞发育潜能的指标[13]。此外，有研究发现，线粒体融合蛋白可通过促进线粒体的融合直接影响线粒体功能，调节线粒体介导的细胞能量产生、自噬及凋亡。在女性生殖系统中，线粒体融合蛋白在调节卵泡发育、促进窦前卵泡向窦卵泡转化、促进卵母细胞成熟以及维持妊娠期子宫内环境稳态等方面有重要意义[14]。

2.CGCs中线粒体作用：近年来，随着ART技术的逐渐成熟，Taugourdeau等[15]发现，CGCs中线粒体数量、分布、DNA(mtDNA)的拷贝数与胚胎质量相关。一项关于卵巢储备功能减退(DOR)和CGCs线粒体相关性的研究表明，CGCs中mtDNA拷贝数降低可能与DOR患者卵母细胞功能受损有关；
因此，CGCs线粒体的某些特征(例如mtDNA拷贝数)可以作为卵母细胞发育潜能的指标[16]。Taugourdeau等[15]评估了人CGCs中mtDNA的拷贝数与相应胚胎植入后怀孕几率之间的关系，发现在IVF过程中，胚胎植入的概率与CGCs中的mtDNA拷贝数密切相关，证明了CGCs中mtDNA定量可作为胚胎植入潜能的生物标记物。Ogino等[17]也发现，CGCs中mtDNA拷贝数可以作为预测优质胚胎的参数。

然而，也有一些研究的结果与上述结论相反。Liu等[18]的研究结果表明，CGCs中mtDNA拷贝数在植入胚胎与未植入胚胎、优质胚胎与劣质胚胎之间均无显著差异；
质优组和质差组相应CGCs的线粒体膜电位、ATP含量和ROS水平均无显著差异；
因此，他们认为CGCs中mtDNA拷贝数的测定对IVF患者的胚胎选择可能无明显指导作用。此外，另有一项关于人类CGCs中mtDNA相对含量和线粒体基因组变异是否与卵母细胞生殖潜能和ART结局相关的研究表明，CGCs中mtDNA拷贝数或特定mtDNA遗传变异的存在与ART结局无关，但与患者体质量指数(BMI)相关，从而认为，分析CGCs中的mtDNA在改善胚胎选择方面无明显优势[19]。这与Liu等[18]的结果一致。从上述研究报道可发现，CGCs中mtDNA拷贝数能否作为预测胚胎质量和胚胎植入的参数的结论并不一致，因此，仍需要我们进一步验证。

1.胚胎培养液：人类ART术的最终目的是成功妊娠，而胚胎质量是影响ART成功率的重要因素，但是目前尚缺乏有效、客观、全面评价胚胎质量的方法。目前临床上采用的判断胚胎能否移植的方法是胚胎形态学评分。最近研究表明，胚胎培养液中胚胎自身分泌的氨基酸、葡萄糖、丙酮酸在胚胎发育过程中至关重要[20]，而胚胎培养液中主要的细胞因子，包括可溶性人白细胞抗原因子-G(sHLA-G)、β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)、血小板活性因子(PAF)、胰岛素样生长因子(IGFs)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-α)、瘦素(leptin)可以作为胚胎发育和植入潜力的指标[21]。研究发现，优质胚胎及种植胚胎的培养液中含有高水平的PAF，因此，PAF水平可以作为挑选具有植入潜力胚胎的指标[22]。

2.胚胎培养液中线粒体作用：线粒体在卵母细胞成熟、受精和早期的胚胎发育中均扮演着重要角色。mtDNA是独立于核DNA之外的能进行半自主复制的遗传物质，在哺乳动物中为母系遗传。当精子在完成受精后，精子能量耗竭，由卵母细胞为受精卵继续发育成胚胎提供能量支持，因此，发育至卵裂期胚胎细胞中的线粒体全部来自于卵母细胞[23]。胚胎发育过程中，线粒体主要通过氧化磷酸化提供ATP，当线粒体受损时，将产生额外的ROS。研究发现，卵裂期胚胎第3天(D3)胚胎质量越好，其ATP水平越高，ROS水平越低[24]，同时胚胎质量越好，胚胎培养液中mtDNA拷贝数越高[25]。体外受精过程中，早期卵裂胚胎的mtDNA拷贝数与卵母细胞中的拷贝数相同，并在囊胚期开始增加；
线粒体的增加可能和胚胎应激有关，胚胎应激能诱导线粒体生物合成，而倍性差异则能诱导蛋白质应激，导致ROS的产生，ROS含量增多反过来破坏线粒体功能，造成线粒体损伤[26]。

有研究表明，胚胎培养液中mtDNA/基因DNA(gDNA)的比率与胚胎质量和生存潜力密切相关，因此，其在临床上可用于挑选具有更好发育潜力的胚胎进行移植[27]。然而，Zhang等[28]的发现与上述结论相反，他们的研究证明胚胎培养液中mtDNA/gDNA虽然和胚胎发育有一定相关性，但尚不能作为临床预测胚胎质量的指标。一项动物实验发现，胚胎培养液中mtDNA拷贝数与胚胎染色体倍性有关，二倍体胚胎发育到囊胚的比率大于单倍体，但二倍体囊胚mtDNA拷贝数低于单倍体囊胚[29]。此外，一项有关胚胎形态学参数与整倍体相关性分析表明，形成囊胚后第3日胚胎质量、囊胚扩张程度与囊胚整倍体状态无关，而活检时间、囊胚内细胞团级别及囊胚滋养层细胞级别与整倍体状态显著相关[30]。

上述研究表明，胚胎培养液中虽只存在微量mtDNA，但经过DNA扩增后仍能获得较多mtDNA，且其在一定程度上可能反映胚胎质量，而且可能作为未来预测胚胎质量的重要标志物。但对mtDNA在胚胎早期发育过程中能否预测胚胎质量及着床率的相关研究仍存在争议，因此仍需大量研究证实上述理论。

综上所述，线粒体是人体内至关重要的细胞器，它通过氧化磷酸化为机体提供ATP，在生殖系统中也不例外。卵母细胞和精子质量是辅助生殖技术中决定胚胎质量及成功妊娠的重要因素。众所周知，在受精过程中，卵母细胞提供了早期胚胎发育的能量来源，这意味着卵母细胞中线粒体的储备至关重要。已有研究发现，卵母细胞中线粒体含量及mtDNA拷贝数与胚胎质量呈正相关[31]。卵母细胞周围的CGCs与胚胎发育过程中胚胎培养液线粒体含量及DNA拷贝数与胚胎质量的相关性成为研究热点，但众多学者的研究结论并不一致，尚无法用于准确判断和预测胚胎质量；
而临床上用于预测胚胎质量的形态学评分并不十分准确，因此找到预测胚胎质量的非侵入性方法显得尤为重要。未来有必要继续开展对卵母细胞周围CGCs和胚胎培养液的研究，以期为改善辅助生殖中胚胎着床及成功妊娠提供理论参考。

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